単離および脳実質細動脈のカニューレ挿入
Summary
This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.
Abstract
実質細動脈、貫通細動脈および前毛細血管細動脈を含む脳実質細動脈（PAは）、脳実質に軟膜動脈および細動脈やダイビングから分岐高抵抗血管です。個々のPAは実質および内に含まれるニューロンの離散的な円筒形の領土を灌流。これらの細動脈は、局所的に脳の血流の両方グローバル（脳血管自動調節）と（機能性充血）の調節において中心選手です。 PAは神経血管ユニット、脳内の代謝活性への局所血流量と一致し、また、ニューロン、介在ニューロン、アストロサイトを含む構造の一部です。 PAを介した灌流は、直接フィードPAの拡張によって引き起こされる局所灌流の増強に、その特定の地域内のニューロンとニューロンの代謝リードの増加の活動にリンクされています。 PAの調節は、より良好に特徴づけとは異なります軟膜動脈。圧力誘起血管収縮は、PAの中で大きくなり、血管拡張メカニズムが異なります。また、PAは血管周囲神経から外因性の神経支配を受けていない – 神経支配は、アストロサイトのエンドフィートとの接触を介して自然の中で、固有かつ間接的です。このように、軟膜動脈を用いた研究によって蓄積された収縮の調節に関するデータは直接PAの機能を理解するには変換されません。さらに、それは、高血圧や糖尿病などの病理学的状態は、PAの構造と反応性をどのように影響するか未定のまま。この知識のギャップは、部分的にPAの分離とカニュレーションに関連する技術的な問題の結果です。この原稿では、げっ歯類のPAの単離およびカニューレ挿入するためのプロトコルを提示します。さらに、我々は、アゴニスト誘導性の収縮および筋原性反応を含む、これらの細動脈、で行うことができる実験の例を示しています。この原稿の焦点は、PAカニューレ挿入および圧力筋運動記録法、孤立したPAにあるが、Sはまた、生化学的、生物物理学的、分子、およびイメージング研究のために使用することができます。
Introduction
脳循環を一意中枢ニューロン、エネルギー貯蔵を制限され、酸素圧力と必要な栄養素の供給の変化に結果的に非常に敏感であるた細胞の代謝要求をサポートするように構成されています。特定のタスクが実行されるときに、特定の神経細胞の亜集団がアクティブになると、血管系は、地元の低酸素や栄養素1の枯渇を防ぐために、灌流の高度に局在化の増加を促進します。これは、アクティブニューロン、アストロサイト、および大脳動脈2から成る、 神経血管カップリングとして知られている機能性充血の一形態であり、そして神経血管ユニットの適切な動作に依存しています。脳実質動脈は、血管、実質を取り囲む貫通し、前毛細血管細動脈の基は、この反応のために集中的に重要であり、神経血管カップリング3を調査するために、個別に研究するために、次に重要です。
<脳内の異なるニューロン集団を潅流 – （70μmの内径20）高抵抗血管のpクラス= "jove_contentは">実質細動脈は小さいです。表面の軟膜動脈から分岐、実質細動脈は地下微小循環（ 図1）を供給するために、ほぼ90ᵒ角度で脳実質に浸透します。これらの細動脈は、彼らが毛細血管を保護する最も遠位の平滑筋を含む血管があるように、適切な灌流圧を維持する上で重要な役割を果たしています。表面軟膜の循環とは対照的に、実質細動脈は、担保の枝と吻合を欠き、その結果、脳循環4の「ボトルネック」です。その結果、実質細動脈の機能不全は、血管認知障害および（またサイレントまたはラクナストロークとして知られている）小虚血性脳卒中などの脳血管疾患の発展に貢献しています。研究はindicatEその実質細動脈の機能不全は、本態性高血圧5、慢性ストレス6により誘導され、および小血管疾患の遺伝的マウスモデル7の初期事象であることができます。ラットにおける単一貫通動脈のさらなる実験的に誘発される閉塞は、古い人間8で観察される円筒形状で、類似している小さな虚血性脳卒中を引き起こすのに十分です。これらの解剖学的な違いに加えて、収縮機能を調節するメカニズムは軟膜動脈および実質細動脈の間で異なります。筋原性血管収縮はおそらく外因性神経支配10の欠如、メカノ11の別個のモード、および細胞内Caの違いにより、実質細動脈9に大きい2+血管平滑筋細胞における12,13に信号を送ります。証拠は、内皮依存性血管拡張剤機構はまた、これらの間で異なることを示唆しているvascuカルシウムが関与するメカニズムのより大きな信頼を示す実質動脈2+活性化K +チャネルおよびそのような一酸化窒素とプロスタサイクリン14などの拡散性因子と比較して血管壁内の電気緊張通信とLARセグメント。したがって、軟膜動脈を用いた実験で収集したデータは必ずしも脳かん流の局所制御の知識のギャップを残して、実質細動脈には適用されない場合があります。
その重要性にもかかわらず、実質細動脈は、主として分離とex vivoでの研究のための実装と技術的な課題に、大幅に下に研究されています。この原稿では、隔離し、圧力筋運動記録法に使用することができ、または免疫標識、電気生理学、分子生物学、および生化学的解析のための組織を分離するためにどの、脳実質細動脈にカニューレを挿入する方法について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
脳実質細動脈は、異なるニューロン集団を灌流少数の吻合や支店を持つ高抵抗細動脈です。これらの専門の血管は、星状細胞媒介血管拡張1を介して脳血管自動調節し、神経血管カップリングの中心的プレーヤーです。脳血管疾患におけるこれらの特殊な血管の重要性は、ミラー博士フィッシャーの先駆的な仕事は、高血圧患者の死後 16の脳内にラクナ梗塞の領土内で?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funded by NHLBI R01HL091905 (SE), the United Leukodystrophy Foundation CADASIL research grant (FD) and AHA 15POST247200 (PWP). The authors would like to thank Samantha P. Ahchay for providing the image on Figure 1, and Dr. Gerry Herrera, Ph.D., for providing critical comments on the manuscript.
Materials
| artificial Cerebrospinal Fluid | |||
| NaCl | Fisher Scientific | S-640 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G2870 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation/ Cannulation | |||
| Stereo Microscope | Olympus | SZX7 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Wiretrol 50 μL | VWR Scientific | 5-000-1050 | |
| 0.2 μm Sterile Syringe Filter | VWR Scientific | 28145-477 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Dark Green Nylon Thread | Living Systems Instrumentation | THR-G | |
| Linear Alignment Single Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1-LIN | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Video Dimension Analyzer | Living Systems Instrumentation | VDA-10 | |
| Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software | Living Systems Instrumentation | DAQ-IWORX-404 | |
| Heating Unit | Warner Instruments | 64-0102 | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
Riferimenti
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