An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.
सभी अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) प्रक्रियाओं प्रयोगशाला बेंच पर प्रदर्शन assays ( "गीला बेंच") और डेटा जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइनों ( "सूखी बेंच") का उपयोग आयोजन विश्लेषण शामिल हैं। दोनों तत्वों को सही और विश्वसनीय परिणाम है, जो नैदानिक प्रयोगशालाओं के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं उत्पादन के लिए आवश्यक हैं। लक्षित NGS प्रौद्योगिकियों तेजी से ऑन्कोलॉजी अनुप्रयोगों में अनुग्रह पाया है अग्रिम सटीक दवा उद्देश्यों को मदद करने के लिए, अभी तक तरीकों अक्सर काट दिया और चर गीले और सूखे बेंच workflows और बेबुनियाद अभिकर्मक सेट शामिल है। इस रिपोर्ट में, हम अनुक्रमण के लिए एक व्यापक लक्षित NGS प्रणाली का एक उदाहरण के रूप में एक 21 जीन पैनल के साथ कैंसर के नमूनों को चुनौती देने के लिए एक विधि का वर्णन है। प्रणाली कार्यात्मक डीएनए मात्रा का ठहराव और योग्यता, एकल-ट्यूब मल्टिप्लेक्स पीसीआर संवर्धन, और पुस्तकालय शुद्धि और सामान्य बनाने के लिए एक स्टैंडअलोन जैव सूचना विज्ञान सूट के साथ विश्लेषणात्मक-सत्यापित, एकल स्रोत अभिकर्मकों का उपयोग एकीकृत करता है।नतीजतन, सटीक संस्करण से कहता कम गुणवत्ता और कम मात्रा formalin तय, आयल एम्बेडेड (FFPE) और एफ एन ए सी (FNA) ट्यूमर बायोप्सी से प्राप्त किया जा सकता है। विधि नियमित तौर पर 400 amplifiable डीएनए प्रतियों की एक इनपुट से कैंसर से जुड़े वेरिएंट आकलन कर सकते हैं, और डिजाइन में मॉड्यूलर नए जीन सामग्री को समायोजित करने के लिए है। विश्लेषणात्मक से परिभाषित नियंत्रण के दो अलग अलग प्रकार की चिकित्सकीय प्रासंगिक नमूनों के साथ गुणवत्ता आश्वासन और मदद की रक्षा कॉल सटीकता प्रदान करते हैं। एक लचीला "टैग" पीसीआर कदम मंच विशेष एडेप्टर और सूचकांक कोड embeds नमूना बारकोडिंग और आम benchtop NGS उपकरणों के साथ संगतता की अनुमति है। महत्वपूर्ण बात है, प्रोटोकॉल सुव्यवस्थित है और एक ही दिन में 24 अनुक्रम तैयार पुस्तकालयों का उत्पादन कर सकते हैं। अंत में, दृष्टिकोण एल्गोरिदम बुला उत्परिवर्तन का पता लगाने सटीकता में सुधार और अंतर झूठी नकारात्मक और indeterm के लिए संस्करण में सीधे पूर्व विश्लेषणात्मक नमूना गुणवत्ता नियंत्रण परिणामों को शामिल करके गीले और सूखे बेंच प्रक्रियाओं लिंकinate कॉल। यह लक्षित NGS विधि दोनों wetware और सॉफ्टवेयर उच्च गहराई, मल्टिप्लेक्स अनुक्रमण और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए विषम कैंसर के नमूनों का विश्लेषण प्राप्त करने के लिए संवेदनशील क्षेत्र में प्रगति का उपयोग करता है।
प्रेसिजन दवा रोगियों के लिए नैदानिक और चिकित्सीय विकल्पों में से वैयक्तिकरण पर निर्भर करता है। रुझान उपचार का वादा रोग मार्ग है कि आणविक निदान और लक्षित चिकित्सा विज्ञान के संबंध में सूचित कर सकते हैं की एक बेहतर समझ का एक सीधा परिणाम है। उदाहरण के लिए, molecularly-लक्षित चिकित्सा के उपयोग के 2013 1 के लिए 2003 से 46% करने के लिए 11% से वृद्धि हुई है, और vemurafenib और crizotinib के रूप में इस तरह के कैंसर रोधी दवाओं साथी नैदानिक परीक्षण के साथ एफडीए को मंजूरी दे दी है। सही अत्यधिक मल्टिप्लेक्स नमूना सेट में कम बहुतायत अनुक्रम लक्ष्यों को ठीक करने के लिए अपनी क्षमता के साथ, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) कैंसर के साथ जुड़े आनुवंशिक aberrations के मूल्यांकन और सटीक दवा के लिए आणविक लक्ष्य की पहचान करने के लिए पसंद की एक विधि के रूप में उभरा है।
आणविक परीक्षण के लिए सबसे आम ठोस ट्यूमर बायोप्सी formalin तय शामिल हैं, आयल एम्बेडेड (FFPE) और एफ एन ए सी (FNA) specimसत्ता। इन नमूनों कम मात्रा और / या कम गुणवत्ता वाले न्यूक्लिक एसिड होता है जो चुनौती देने के सटीक आकलन NGS 2-5 से भरा है। इन नमूनों के विश्लेषण के लिए वर्तमान वाणिज्यिक NGS तरीकों अलग अभिकर्मकों, प्रोटोकॉल, और सूचना विज्ञान उपकरण है कि लगातार सुधार की चलती लक्ष्य प्रतिनिधित्व का घपला पर आधारित हैं। उदाहरण के लिए, परख chemistries और / या सॉफ्टवेयर में परिवर्तन के सबसे अधिक इस्तेमाल किया लक्षित NGS किट 6 के लिए हर 1-2 महीने हुई। इस अस्थिरता के निर्माण और चुनौतीपूर्ण नमूना प्रकार के लिए एक एकीकृत प्रणाली NGS की पुष्टि करने, विशेष रूप से कैंसर के परीक्षण के लिए में जुटना की कमी को दर्शाता है, और प्रयोगशालाओं पर एक अनुचित बोझ डालता एकजुट प्रोटोकॉल है कि नमूना परिणामों से अनुकूलित कर रहे हैं विकसित करने के लिए। दरअसल, NGS उपयोगकर्ताओं में से एक ताजा सर्वेक्षण में इन प्रौद्योगिकियों "तेजी से बदलते" की कठिनाइयों पर प्रकाश डाला, की स्थापना की, चिकित्सकीय कार्रवाई सामग्री, आरोपित जैव सूचना विज्ञान विशेषज्ञता, एक solidifi के लिए आवश्यकताओं के साथ-साथएड और एकीकृत प्रक्रिया है कि तेजी से लागू किया जा सकता है, और सुव्यवस्थित workflows और सरलीकृत प्रोटोकॉल है कि नौकरी पर प्रशिक्षण 7 की सुविधा। इस अनुच्छेद में, लक्षित NGS के लिए एक व्यापक प्रणाली में वर्णित है कि इन कमियों को संबोधित किया जाता है।
प्रस्तुत कार्यप्रणाली चिकित्सकीय प्रासंगिक कैंसर जीन loci के NGS के लिए सटीकता, संवेदनशीलता, और लक्ष्य मात्रा का ठहराव और पता लगाने की विश्वसनीयता में सुधार करने के लिए दोनों गीले और सूखे बेंच पर पूर्व विश्लेषणात्मक करने के लिए पोस्ट-विश्लेषणात्मक से सभी प्रक्रियात्मक कदम एकीकृत करता है। यह दृष्टिकोण डीएनए गुणवत्ता का आकलन करने के लिए, झूठी सकारात्मक कहता है कि बहुत कम टेम्पलेट प्रतियों की पूछताछ से उत्पन्न कर सकते खिलाफ पीसीआर संवर्धन कदम में इनपुट, और गार्ड मार्गदर्शन "कार्यात्मक" डीएनए 4 की मात्रा का ठहराव के साथ शुरू होता है। एक एकल-ट्यूब मल्टीप्लेक्स पीसीआर तो केवल 400 amplifiable डीएनए प्रतियों का उपयोग कर 46 से 21 में लोकी कैंसर के जीन के लिए समृद्ध करती, NGS usin के लिए मंच विशेष दृश्यों का समावेश के द्वारा पीछाजी आम डेस्कटॉप अनुक्रमण उपकरणों। पुस्तकालय एक साधारण चुंबकीय मनका प्रक्रिया का उपयोग कर शुद्ध और एक उपन्यास, अंशांकन मुक्त qPCR परख के साथ मात्रा निर्धारित कर रहे हैं। एक स्टैंडअलोन जैव सूचना विज्ञान सुइट, द्वारा नमूना डीएनए क्यूसी परिणाम सूचित कॉल के प्रदर्शन में सुधार करने के लिए, NGS निम्नलिखित अनुक्रम विश्लेषण प्रदान करता है। हम लक्षित NGS के लिए इस सिस्टम के दृष्टिकोण का उपयोग कर डेटा मौजूद आधार प्रतिस्थापन म्यूटेशन, सम्मिलन / विलोपन (indels) प्रकट करने के लिए, और कॉपी नंबर वेरिएंट (CNVs) ऐसे FFPE और FNA नमूने, और चलाने के रूप में कम गुणवत्ता वाले और कम मात्रा में ट्यूमर बायोप्सी में नियंत्रित करता है।
NGS प्रौद्योगिकियों नैदानिक सेटिंग 9 में ट्यूमर बायोप्सी की आणविक प्रोफाइल पूछताछ के लिए उम्मीदों नए सिरे से परिभाषित किया है। लक्षित NGS पैनल के एक नंबर शोध प्रौद्योगिकी प्रयोगशाला विकसित परीक्षण, और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उत्पादों और कस्टम पैनलों नैदानिक नमूनों 3,5,10-15 के कई प्रकार का आकलन करने के लिए के रूप में विकसित किया गया है। कई अध्ययनों से रिपोर्ट जीनोमिक परिवर्तन 3,10-12,14 का पता लगाने के लिए एक संवेदनशील और विशिष्ट नैदानिक उपकरण के रूप में NGS के मूल्य का प्रदर्शन किया है। फिर भी पढ़ाई भी कलाकृतियों जो इस तरह के FFPE नमूनों 2-5,12,14 के रूप में चुनौतीपूर्ण कैंसर बायोप्सी से झूठी सकारात्मक परिणाम हो सकता है के जोखिम का प्रदर्शन किया है। इसके अतिरिक्त, हाल के प्रकाशनों नमूनों ऑन्कोलॉजी का उपयोग कर NGS के लिए उच्च विफलता दर पर प्रकाश डाला है कि कम इनपुट डीएनए 12 के उपयोग से बढ़ रहे हैं वाणिज्यिक लक्षित NGS पैनल के साथ 16 और झूठी सकारात्मक कॉल है। नतीजतन, कुछ प्रयोगशालाटोरी या तो संशोधित या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लक्षित NGS प्रौद्योगिकियों के प्रदर्शन में सुधार करने के लिए, अक्सर सटीकता सुनिश्चित या निष्कर्षों की पुष्टि bioinformatic से विश्लेषण करती है 5,10,11 करने के लिए अतिरिक्त नियंत्रण और संतुलन को शामिल किया है।
21-जीन पैनल (चित्रा 2) ऐसे FFPE और FNA ट्यूमर बायोप्सी के रूप में चुनौतीपूर्ण नमूना प्रकार के सबूत के आधार पर कार्रवाई म्यूटेशन से पूछताछ करने के लिए एक व्यापक NGS प्रणाली के लिए लक्षित सामग्री के रूप में विकसित किया गया था। कार्यप्रवाह लाभ के एक नंबर है: 1) वर्दी amplicon कवरेज (आंकड़े 3 और 4, 3 टेबल) प्रदान करके स्थिरता; 2) आसानी से उपयोग प्रदान करके पूर्व तैयार की, अनुकूलित अभिकर्मक सेट, और जैव सूचना विज्ञान आवश्यकताओं को सरल बनाने के; 3) कार्यप्रवाह को व्यवस्थित बनाने और pipetting कदम की संख्या को कम करने के अन्य वाणिज्यिक NGS तरीकों की तुलना में से दक्षता; और 4) amplifi का आकलन करने के लिए एक डीएनए क्यूसी परख शामिल करके सटीकतासक्षम डीएनए नकल संख्या स्वीकार्य टेम्पलेट विविधता को सुनिश्चित करने और संस्करण का पता लगाने 4 में स्टोकेस्टिक उतार चढ़ाव से बचने के लिए। जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के साथ पूर्व विश्लेषणात्मक क्यूसी डेटा के एकीकरण FFPE डीएनए के कम आदानों के लिए अनुमति देता है। इस सच्चाई का स्वतंत्र उपायों के साथ 400 FFPE नमूने भर में डीएनए इनपुट के विभिन्न कार्यात्मक प्रतियों का उपयोग कर एक निर्णय पेड़ एल्गोरिथ्म प्रशिक्षण, और bioinformatic सॉफ्टवेयर में इस एल्गोरिथ्म को शामिल करके हासिल की थी। नतीजतन, 400 amplifiable प्रतियां, आम तौर पर FFPE डीएनए के ~ 5-20 एनजी के बराबर की सिफारिश की इनपुट, अन्य तरीकों 10-12, संकरण आधारित संवर्धन सहित जहां FFPE डीएनए के ~ 250 एनजी 17,18 सिफारिश की है के लिए अनुकूल तुलना । तकनीक एक MiSeq मंच पर इस्तेमाल के लिए वर्णन किया गया है हालांकि, यह साधन-विशिष्ट एडाप्टर के साथ टैग पीसीआर प्राइमरों का उपयोग अन्य NGS प्लेटफार्मों पर अनुक्रम विश्लेषण सक्षम करने के द्वारा संशोधित किया जा सकता है।
कई कदम सफलता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैंप्रक्रिया की। पूर्व विश्लेषणात्मक क्यूसी परख डीएनए और रिपोर्ट कार्यात्मक निषेध की amplifiable प्रतिलिपि संख्या निर्धारित करता है। हालांकि, अगर कम से कम 400 amplifiable डीएनए पीसीआर प्रतियां संवर्धन कदम में उपयोग किया जाता है, वहाँ एक झूठी नकारात्मक (चित्रा 6) कम बहुतायत परिवर्तन के साथ नमूनों से कॉल का खतरा बढ़ गया है। इसके अतिरिक्त, देखभाल धोने या क्षालन चरणों के दौरान चुंबकीय मोतियों की ओवर-सुखाने को रोकने के लिए पुस्तकालय शुद्धि के दौरान लिया जाना चाहिए। इसके अलावा, सफल पुस्तकालय मात्रा का ठहराव पुस्तकालय डीएनए का सही कमजोर पड़ने पर अत्यधिक निर्भर है। सबसे अच्छा परिणाम के लिए, qPCR के अंतर नमूना पुस्तकालय (सीक्यू परिवार) LQ स्टैंडर्ड (सीक्यू विक) की तुलना के लिए परिणाम होना चाहिए ≤3.3 Cq। अंतर अधिक से अधिक 3.3 सीक्यू, फिर से कमजोर पड़ने और नमूने का परीक्षण कर रहा है तो सिफारिश की है। प्रस्ताव है कि एक उत्कृष्ट सहसंबंध इस प्रतिस्पर्धी qPCR विधि और वाणिज्यिक किट के बीच मनाया गया है हालांकि एक मानक वक्र का उपयोग पूर्ण मात्रा का ठहराव, एक अन्य तरीकों की प्रतिरूप प्रवर्धन कदम रिश्तेदार में पुस्तकालय इनपुट की भरपाई इष्टतम बोने घनत्व को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है।
कुछ कैंसर के नमूनों विशेषकर इसलिए क्योंकि अवरोधकों कि डीएनए अलगाव के बाद जारी रहती है के अनुक्रम के चुनौती दे रहे हैं। पुस्तकालय तैयारी के लिए इन नमूनों की पहचान करने से पहले, qPCR क्यूसी परख भी है कि दोनों एक आंतरिक नियंत्रण और कार्यात्मक निषेध के लिए एक प्रहरी के रूप में कार्य करता है एक exogenous टेम्पलेट शामिल करके प्रवर्धन निषेध का पता लगाता है। एक उदाहरण चित्रा 3 जिसमें एक मेलेनोमा डीएनए नमूने क्यूसी निषेध मीट्रिक अनुक्रमण करने से पहले पारित करने में विफल है और फिर एक पुस्तकालय है कि अनुक्रम किया जा सकता है उत्पन्न करने में विफल में प्रस्तुत किया है। असफलता की संभावना मेलेनिन संदूषण, एक ज्ञात पीसीआर अवरोध, FFPE डीएनए अलगाव कदम से खत्म किया का परिणाम था। नमूने है कि क्यूसी परख द्वारा पहचाने जाते हैं प्रवर्धन की विफलता के लिए खतरा हो सकता है के लिए एक अतिरिक्त साफ-अप कदम टी के माध्यम से बचाया जा सकता हैओ संभावित अवरोधकों को हटा दें।
लक्षित 21-जीन पैनल सबूत के आधार पर जीन के आकर्षण के केंद्र पर केंद्रित है और अनुकूलित अभिकर्मकों और डीएनए क्यूसी, NGS और जैव सूचना विज्ञान सॉफ्टवेयर है कि द्वारा पूर्व विश्लेषणात्मक "कार्यात्मक" डीएनए मात्रा का ठहराव परिणाम सूचित किया जाता है के लिए नियंत्रण के साथ एक पूरी प्रणाली प्रदान करता है। विधि सही कम इनपुट डीएनए से आधार-प्रतिस्थापन म्यूटेशन और indels का पता लगाता है, और पैनल सामग्री का विस्तार करने के लिए, इस तरह के रूप में अतिरिक्त CNVs वेरिएंट पता लगाने के लिए और लक्षित आरएनए अनुक्रमण के लिए अनुकूलित किया जा विकल्प के साथ एक NGS प्रणाली का एक उदाहरण है।
The authors have nothing to disclose.
हम पांडुलिपि की समीक्षा के लिए डॉ एनेट Schlageter धन्यवाद। इस काम के कैंसर की रोकथाम और टेक्सास के अनुसंधान संस्थान (: GJL पीआई) से अनुदान CP120017 द्वारा समर्थित किया गया था।
2x Quantidex Master Mix | Asuragen | 145345 | |
Quant Primer Probe Mix | Asuragen | 145336 | |
Inhibition Primer Probe Mix | Asuragen | 145344 | |
ROX | Asuragen | 145346 | |
Diluent | Asuragen | 145339 | |
DNA Standard (50) | Asuragen | 145340 | |
DNA Standard (10) | Asuragen | 145341 | |
DNA Standard (2) | Asuragen | 145342 | |
DNA Standard (0.4) | Asuragen | 145343 | |
2X Amplification Master Mix | Asuragen | 145348 | |
Pan Cancer Primer Panel | Asuragen | 145347 | |
Pan Cancer FFPE Control | Asuragen | 145349 | |
Pan Cancer Multi-Variant Control | Asuragen | 145350 | |
Library Pure Prep Beads | Asuragen | 145351 | |
Wash Buffer | Asuragen | 145352 | |
Elution Buffer | Asuragen | 145353 | |
2X LQ Master Mix | Asuragen | 145358 | |
LQ Diluent | Asuragen | 145354 | |
LQ Positive Control | Asuragen | 145355 | |
LQ Standard | Asuragen | 145356 | |
LQ Primer / Probe Mix (ILMN) | Asuragen | 145357 | |
LQ ROX | Asuragen | 145359 | |
Index Codes (ILMN) – Set A, AIL001 – AIL048 (48) | Asuragen | 150004 | |
AIL001 – AIL048 (48) | |||
Index Codes (ILMN) – Set B, AIL049 – AIL096(48) | Asuragen | 150005 | |
AIL049 – AIL096(48) | |||
2X Index Master Mix | Asuragen | 145361 | |
Read 1 Sequencing Primers | Asuragen | 150001 | |
Index Read Sequencing Primers | Asuragen | 150002 | |
Read 2 Sequencing Primers | Asuragen | 150003 | |
Sequencing Diluent | Asuragen | 145365 | |
Illumina MiSeq | Illumina | ||
MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle) | Illumina | MS-102-3003 | |
MiSeq Reagent Nano Kit v2 (300-cycle) | Illumina | MS-103-1001 | |
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
Magnetic Stand-96 (Or equivalent device) | Ambion | AM10027 | |
Quantidex Reporter Software | Asuragen |