An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.
Alle neste generasjons sekvensering (NGS) prosedyrer inkluderer analyser utført ved laboratoriebenken ( "våt benken") og dataanalyser utført ved bruk av bioinformatikk rørledninger ( "tørr benk"). Begge elementer er viktig for å produsere nøyaktige og pålitelige resultater, som er spesielt kritisk for kliniske laboratorier. Målrettede NGS teknologi har stadig funnet nåde hos onkologi programmer for å hjelpe forhånd presisjon medisin mål, men metodene ofte involverer frakoblet og variable våte og tørre benk arbeidsflyt og ukoordinerte reagenvolumer sett. I denne rapporten beskriver vi en fremgangsmåte for sekvensering utfordrende cancerprøver med en 21-gen panel som et eksempel på en omfattende målrettet NGS system. Systemet integrerer funksjonelle DNA kvantifisering og kvalifisering, single-tube multiplex PCR berikelse, og bibliotek rensing og normalisering ved hjelp av analytisk verifisert, single-source reagenser med en frittstående bioinformatikk suite.Som et resultat av samtaler nøyaktig variant fra lav kvalitet og lav mengde formalinfiksert, parafininnebygd (FFPE) og finnålsaspirasjon (FNA) tumor biopsier kan oppnås. Metoden kan rutinemessig vurdere kreft-assosiert varianter fra en inngang på 400 amplifiserbare DNA-kopier, og er modulær design for å imøtekomme nye genet innhold. To forskjellige typer analytisk definerte kontroller kvalitetssikre og bidra til å sikre samtale nøyaktighet med klinisk relevante prøver. En fleksibel "tag" PCR trinnet bygger plattformspesifikke adaptere og indekskoder for å tillate prøve barcoding og kompatibilitet med vanlige stasjonære NGS instrumenter. Viktigere er protokollen strømlinjeformet og kan produsere 24 sekvens klar bibliotekene på en enkelt dag. Til slutt kobler tilnærming våte og tørre benk prosesser ved å innlemme pre-analytiske prøven kvalitetskontroll resultatene direkte inn i varianten ringer algoritmer for å forbedre mutasjonsdeteksjon nøyaktighet og skille falske negative og indeterminate samtaler. Denne målrettede NGS metoden bruker fremskritt innen både wetware og programvare for å oppnå høy dybde, multiplex sequencing og sensitiv analyse av heterogene kreftprøver for diagnostiske applikasjoner.
Precision medisin er avhengig av individualisering av diagnostiske og terapeutiske muligheter for pasientene. Løftet av skreddersydde behandlinger er en direkte konsekvens av en bedre forståelse av sykdoms veier som kan informere kobling av molekylær diagnostikk og målrettede behandlingsformer. For eksempel, bruk av molekylært målrettet terapi økt fra 11% til 46% 2003-2013 1, og anti-kreft stoffer som vemurafenib og crizotinib er FDA-klarert med følges diagnostiske tester. Med sin evne til å nøyaktig gjenopprette lav overflod sekvens mål over svært multipleksede prøvesettene, har neste generasjons sekvensering (NGS) dukket opp som en metode for valg for å vurdere genetiske avvik knyttet til kreft og identifisere molekylære mål for presisjon medisin.
De vanligste solide svulster biopsier for molekylær testing inkluderer formalinfiksert, parafininnebygd (FFPE) og finnålsaspirasjon (FNA) specimens. Disse prøvene er nervøs med lav mengde og / eller lav kvalitet nukleinsyrer som utfordrer nøyaktig NGS vurderinger som 2-5. Gjeldende kommersielle NGS metoder for analyse av disse prøvene er basert på et lappeteppe av ulike reagenser, protokoller og IT-verktøy som representerer bevegelige mål av kontinuerlige forbedringer. For eksempel endringer i analyse kjemi og / eller programvare som skjedde hver 1-2 måneder for de mest brukte målrettede NGS kits 6. Dette ustabilitet reflekterer en mangel på sammenheng i å bygge og verifisere en enhetlig NGS system for utfordrende prøvetyper, spesielt for kreft testing, og legger en uforholdsmessig byrde på laboratorier for å utvikle sammenhengende protokoller som er optimalisert fra prøve-til-resultater. Faktisk en fersk undersøkelse av NGS brukere uthevet vanskelighetene med disse "raskt skiftende" teknologier, sammen med kravene til etablerte, medisinsk-praktisk innhold, forskanset bioinformatikk kompetanse, en solidified og integrert prosedyre som kan implementeres raskt, og effektiv arbeidsflyt og forenklede protokoller som letter on-the-job training 7. I denne artikkelen er et omfattende system for målrettet NGS beskrevet som løser disse hullene.
Den presenterte metodikken integrerer alle prosessuelle skritt fra pre-analytisk til post-analytisk på både våte og tørre benker å forbedre nøyaktigheten, følsomhet og pålitelighet av målet kvantifisering og gjenkjenning for NGS av klinisk relevant kreft genet loci. Denne tilnærmingen begynner med kvantifisering av "funksjonelle" DNA 4 for å vurdere DNA kvalitet, veilede innspill til PCR berikelse trinnet, og vakt mot falske positive samtaler som kan oppstå fra avhøret av svært lave mal eksemplarer. En enkelt-rør multipleks PCR deretter beriker for 46 loci i 21 kreftgener med kun 400 amplifiserbare DNA-kopier, etterfulgt av inkorporering av plattformspesifikke sekvenser for NGS using vanlig desktop-sekvense instrumenter. Bibliotekene blir renset ved anvendelse av en enkel magnetiske kuler prosedyre og kvantifisert med en ny, kalibrering-fri qPCR-analyse. En frittstående bioinformatikk suite, informert av prøve DNA QC resultatene til å forbedre samtalen ytelse, gir sekvens analyse følgende NGS. Vi presenterer data ved hjelp av denne systemtilnærming for målrettet NGS å avsløre grunnerstatning mutasjoner, innsetting / slettinger (indels), og kopiere antall varianter (CNVs) i lav kvalitet og lav mengde tumor biopsier som FFPE og FNA prøver, og løp kontroller.
NGS teknologier har redefinert forventninger til avhør de molekylære profiler av tumor biopsier i kliniske settinger 9. En rekke målrettede NGS panelene har blitt utviklet som forsknings teknologier, laboratorie utviklet tester og kommersielt tilgjengelige produkter og tilpassede paneler for å vurdere flere typer kliniske prøver 3,5,10-15. Rapporter fra flere studier har vist verdien av NGS som en sensitiv og spesifikk klinisk verktøy for påvisning av genomiske forandringer 3,10-12,14. Likevel studier har også vist at risikoen for gjenstander som kan føre til falske positive resultater fra utfordrende kreft biopsier som FFPE eksemplarer 2-5,12,14. I tillegg har nyere publikasjoner uthevet høye feilrater for NGS bruker onkologi eksemplarer 16 og falske positive samtaler med kommersielle målrettede NGS paneler som forverres ved bruk av lav-inngang DNA 12. Som et resultat, noe laborakonservative har enten endret eller lagt til flere sjekker og balanserer til kommersielt tilgjengelige målrettede NGS teknologier for å forbedre ytelsen, ofte å sikre nøyaktighet eller bekrefte funnene fra bioinformatiske analyser 5,10,11.
Den 21-gen panel (figur 2) ble utviklet som målrettet innhold for en omfattende NGS system for å avhøre evidensbaserte, handlings mutasjoner i utfordrende prøvetyper som FFPE og FNA tumor biopsier. Arbeidsflyten har en rekke fordeler: 1) konsistens ved å gi jevn amplicon dekning (figur 3 og 4, Tabell 3); 2) lette-av-bruk ved å gi pre-formulert, optimalisert Reagent sett, og forenkle bioinformatikk krav; 3) effektivitet ved å effektivisere arbeidsflyten og redusere antall pipetteringstrinn i forhold til andre kommersielle NGS metoder; og 4) nøyaktighet ved å innlemme en DNA-QC assay for vurdering av Amplifistand DNA kopiantall for å sikre akseptabel mal mangfold og unngå stokastiske svingninger i variant deteksjon fire. Integreringen av pre-analytiske QC data med bioinformatikk analyse åpner for lave tilførsler av FFPE DNA. Dette ble oppnådd ved å trene en beslutnings tre algoritme ved hjelp av ulike funksjonelle kopier av DNA-inngang over 400 FFPE-prøver med uavhengige mål på sannheten, og innlemme denne algoritmen i den bioinformatiske programvare. Som et resultat, er den anbefalte input av 400 amplifiserbare eksemplarer, typisk tilsvarende ~ 5-20 ng FFPE-DNA, sammenligner gunstig med andre metoder 10-12, inkludert hybridisering basert anrikning hvor ~ 250 ng av DNA FFPE anbefales 17,18 . Selv om den teknikk som er beskrevet for bruk på en MiSeq plattform, kan det bli modifisert ved hjelp av PCR-primere Tag med instrument-spesifikk adaptere for å gjøre det mulig sekvensanalyse på andre NGS plattformer.
Flere trinn er avgjørende for å sikre suksessav prosedyren. Den pre-analytiske QC analysen bestemmer det forøkbare kopiantallet av DNA og rapporter funksjonell inhibering. Imidlertid, hvis mindre enn 400 amplifiserbare DNA-kopier blir brukt i PCR-oppformering trinnet, er det en økt risiko for et falskt negativt anrop fra prøver med lav-overflod mutasjoner (figur 6). I tillegg må man være forsiktig under bibliotek rensing for å forhindre overtørking av de magnetiske kuler under vaske- eller eluering trinn. Dessuten er vellykket bibliotek kvantifisering svært avhengig av nøyaktig fortynning av bibliotek DNA. For det beste resultatet, vil forskjellen i qPCR resultater for prøven biblioteket (Cq FAM) sammenlignet med LQ Standard (Cq VIC) bør være ≤3.3 Cq. Dersom forskjellen er større enn 3,3 Cq, re-fortynning og testing av prøven er anbefalt. Selv om en god korrelasjon har blitt observert mellom denne konkurranse qPCR metoden og kommersielle kits som tilbyr absolutt kvantifisering ved hjelp av en standard kurve, En forskyvning av biblioteket tilførsel til klonale forsterkningstrinn i forhold til andre fremgangsmåter kan være nødvendig for å oppnå optimal poding tetthet.
Noen kreftprøver er spesielt utfordrende å sekvensere grunn av inhibitorer som vedvarer etter DNA isolering. For å identifisere disse prøvene før biblioteket forberedelse, qPCR QC analysen påviser også forsterkning hemming ved å inkludere en eksogen mal som fungerer som både en intern kontroll og et fast punkt for funksjonell hemming. Et eksempel er vist i figur 3 hvor et melanom DNA-prøve mislyktes i å passere QC inhibering metrisk før sekvensering og deretter ikke klarte å generere et bibliotek som kan bli sekvensert. Svikten var sannsynligvis en konsekvens av melanin forurensning, en kjent PCR-inhibitor, overført fra FFPE DNA isoleringstrinnet. Prøver som er identifisert av QC analyse for å være i faresonen for forsterkning svikt kan være berget gjennom en ekstra opprydding trinn to fjerne potensielle hemmere.
Den målrettede 21-gen panel fokuserer på evidensbaserte genet hotspots og gir et komplett system med optimaliserte reagenser og kontroller for DNA QC, NGS og bioinformatikk programvare blir informert av pre-analytiske "funksjonelle" DNA kvantifisering resultater. Fremgangsmåten detekterer nøyaktig basis-substitusjonsmutasjoner og indels fra lav-inngang DNA, og et eksempel på et NGS system med mulighet for å ekspandere panelet innhold, for å detektere ytterligere varianter som CNVs og være tilpasset for målrettet RNA-sekvensering.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Annette Schlageter for gjennomgang av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet delvis av tilskudd CP120017 fra Cancer Prevention and Research Institute of Texas (PI: GJL).
2x Quantidex Master Mix | Asuragen | 145345 | |
Quant Primer Probe Mix | Asuragen | 145336 | |
Inhibition Primer Probe Mix | Asuragen | 145344 | |
ROX | Asuragen | 145346 | |
Diluent | Asuragen | 145339 | |
DNA Standard (50) | Asuragen | 145340 | |
DNA Standard (10) | Asuragen | 145341 | |
DNA Standard (2) | Asuragen | 145342 | |
DNA Standard (0.4) | Asuragen | 145343 | |
2X Amplification Master Mix | Asuragen | 145348 | |
Pan Cancer Primer Panel | Asuragen | 145347 | |
Pan Cancer FFPE Control | Asuragen | 145349 | |
Pan Cancer Multi-Variant Control | Asuragen | 145350 | |
Library Pure Prep Beads | Asuragen | 145351 | |
Wash Buffer | Asuragen | 145352 | |
Elution Buffer | Asuragen | 145353 | |
2X LQ Master Mix | Asuragen | 145358 | |
LQ Diluent | Asuragen | 145354 | |
LQ Positive Control | Asuragen | 145355 | |
LQ Standard | Asuragen | 145356 | |
LQ Primer / Probe Mix (ILMN) | Asuragen | 145357 | |
LQ ROX | Asuragen | 145359 | |
Index Codes (ILMN) – Set A, AIL001 – AIL048 (48) | Asuragen | 150004 | |
AIL001 – AIL048 (48) | |||
Index Codes (ILMN) – Set B, AIL049 – AIL096(48) | Asuragen | 150005 | |
AIL049 – AIL096(48) | |||
2X Index Master Mix | Asuragen | 145361 | |
Read 1 Sequencing Primers | Asuragen | 150001 | |
Index Read Sequencing Primers | Asuragen | 150002 | |
Read 2 Sequencing Primers | Asuragen | 150003 | |
Sequencing Diluent | Asuragen | 145365 | |
Illumina MiSeq | Illumina | ||
MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle) | Illumina | MS-102-3003 | |
MiSeq Reagent Nano Kit v2 (300-cycle) | Illumina | MS-103-1001 | |
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
Magnetic Stand-96 (Or equivalent device) | Ambion | AM10027 | |
Quantidex Reporter Software | Asuragen |