Neutrophiles Isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire Sensibilité aux agents thérapeutiques

Summary

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Abstract

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils ≥ 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Introduction

Les cellules immunitaires innées constituent une partie essentielle des cellules dans le microenvironnement de la tumeur et ont été associés à une tumeur maligne chez les patients et les modèles animaux de cancer ^1. Récemment, il est devenu plus largement apprécié que les réponses immunitaires chroniques jouent un rôle crucial dans la promotion de la progression tumorale, les métastases et la résistance aux chimiothérapies ^2. Les macrophages sont des cellules immunitaires innées importantes qui ont été montrés pour réguler directement la réponse des cellules tumorales à la chimiothérapie ^3,4. Cependant, le rôle des neutrophiles, des acteurs clés dans le système immunitaire inné, dans la régulation de la réponse tumorale au traitement anti-cancéreux est inconnue. Les objectifs de ces protocoles sont d'utiliser une méthode rapide et crédible pour séparer les neutrophiles provenant des échantillons de sang CLL du patient et de différencier les cellules HL60 le long de la voie granulocytaire afin d'étudier leur rôle dans la régulation de la sensibilité des cellules de lymphome à des agents anti-lymphome.

<p class= "jove_content"> Les neutrophiles sont le composant cellulaire le plus abondant du système immunitaire inné dans le sang ⁵ et agir comme une première ligne de défense contre les micro – organismes envahisseurs ^6. Les neutrophiles ont un rôle essentiel dans la hausse des réponses immunitaires innées efficaces en plus de fonctions effectrices variables dans plusieurs états pathologiques ^7. Par conséquent, un procédé rapide et fiable pour isoler neutrophiles à partir d' autres cellules sanguines, telles que la méthode de séparation par gradient de densité, est nécessaire pour des études in vitro. L' utilisation de cette méthode pour l' isolement des cellules neutrophiles facilitera de nouvelles recherches sur les fonctions immunologiques à médiation par les neutrophiles in vivo et ex vivo.

La capacité d'obtenir des populations pures de neutrophiles est une première étape importante pour l'étude des patients atteints de maladies immunologiques ^8. Densité procédé de séparation par gradient est une technique idéale dans laquelle un rendement élevé de cellules est obtenue. La méthod comprend l'ajout d'une solution à gradient de densité dans le fond d'un tube contenant du sang humain dilué suivi par une centrifugation à 300 g pendant 35 min sans pause. L'anneau des cellules mononucléaires apparaît à l'interface et les neutrophiles réside en dessous de la première. Cette méthode possède des avantages significatifs par rapport aux autres méthodes disponibles tels que des kits d'isolement neutrophiles qui sont beaucoup plus chers ^9. En outre, l'isolement des neutrophiles du sang humain par des kits commerciaux utilisant des anticorps dirigés contre un marqueur de surface spécifique pour les neutrophiles humains, augmentent le risque d'une activation ou la différenciation cellulaire. Densité procédé de séparation par gradient permet l'isolement des neutrophiles dans un court laps de temps. Dans le même temps, les cellules mononucléaires sont également séparés et récupérés. C'est une technique fondamentale dans laquelle un rendement élevé de cellules pur est obtenu afin d'obtenir l'intégrité fonctionnelle.

Afin d'imiter le microenv tumoralironnement, des expériences 3D ont été réalisées. Compte tenu de la courte demi-vie des neutrophiles in vitro, les expériences en 3D avec des neutrophiles humains fraîches ne sont pas concluants. Pour cette raison, promyélocytaire (HL60), les cellules sont amenées à se différencier en cellules neutrophiles-like en utilisant les inducteurs de différenciation diméthylsulfoxyde (DMSO) et de l'acide rétinoïque (RA). En utilisant des cellules HL60 différenciées (HL60 diff) permettra d' éviter d' avoir des réponses différentes de neutrophiles en raison de l' isolement de différents donateurs.

En 3D vitro des modèles de culture représentent une étape intermédiaire entre les modèles 2D in vitro et dans des modèles in vivo. Dans la culture 2D, les cellules réparties sur une surface plastique formant des pièces jointes de cellules anormales aux protéines déposées qui sont dénaturées sur cette surface synthétique. A l'inverse, les cellules en forme de culture 3D cellule-cellule naturelle jointes depuis les cellules et la matrice extracellulaire sont elles synthétisent le matériau naturel auquel ils sont attachés.Pour cette raison, les modèles de co-culture en 3D, en particulier entre les cellules cancéreuses et d'autres types de cellules, ont été très utiles pour indiquer leur contribution à la croissance tumorale, l'angiogenèse et les métastases. Par conséquent, les cultures 3D rendent la culture cellulaire miment les conditions physiologiques qui existent in vivo ^10.

Protocol

1. neutrophiles isolement et co-culture avec des cellules leucémiques primaires NOTE: Les procédures ont été menées sous l'approbation du comité d'éthique de l'Hôpital Lyon avec tous les patients signent un consentement éclairé. Isolement des cellules leucémiques primaires et neutrophiles Collecter des tubes de sang périphérique sur EDTA (1,8 mg EDTA par millilitre de sang) provenant de patients diagnostiqués avec la leucémie ly…

Representative Results

Densité procédé de séparation par gradient décrite ici fournit des cellules leucémiques primaires et des neutrophiles non stimulés isolés à partir du sang des patients atteints de LLC La figure 1A représente les différentes couches de sang obtenus après gradient de densité de centrifugation (de haut en bas. Plaquettes et de plasma, cercle blanc représente les cellules mononucléaires, solution à gradient de densité, les granulocytes et les globules rouges…

Discussion

Décrite ici, un protocole efficace, simple, rapide et peu coûteux pour l'isolement des neutrophiles du sang humain avec une grande pureté en utilisant un gradient de densité approche de centrifugation et dans les mêmes cellules étape mononucléaires sont également séparés et valorisés. Les populations de cellules isolées sont ≥90% pur.

Plusieurs méthodes sont disponibles pour l'isolement des cellules neutrophiles du sang humain. Ceux – ci comprennent des procédés simi…

Materials

RPMI 1640	Gibco Invitrogen	21875-034
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco Invitrogen	10270-106
Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium)	Gibco Invitrogen	14040-091
N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine)	Life technologies	25030-024
Penicillin streptomycin (Pen Strep)	Life technologies	15140-122
Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib)	CliniSciences	A3001
Vincristine	EG labo
BD Matrigel basement membrane matrix	BD Biosciences	354234	Put at 4 oC overnight before the day of the experiment
Red cell lysis buffer	BD Biosciences	555899
Ficoll (Pancoll)	PAN Biotech	P04-60500
Dextran	Sigma-Aldrich	D8906
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Sodium chloride (NaCl)	Euromedex	S3014
Annexing V-FLOUS staining kit	Roche	11 988 549 001
Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit	Cosmos Biomedical	CB361550-0000
LSRII flow cytometry	BD Biosciences
Cytocentrifuge	Thermo Scientific
Leica DMR-XA microscope	Leica Microsystems
Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter	Nexcelom  Bioscience