Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.
En ny disseksjon og registreringsteknikk er beskrevet for optisk overvåkning farging og de-farging av lansettformete klemmene som omgir hårsekker i huden på mus ytre øret. Preparatet er enkel og relativt rask, pålitelig som gir omfattende regioner i flere merkede enheter av levende nerveterminaler for å studere opptak og frigjøring av styryl pyridinium fargestoffer som benyttes mye i studier av vesikkel resirkulering. Oppdeling av forberedelsene før merking tillater test kontra kontroll sammenligninger i det samme øret fra en enkeltperson. Nyttige tips er gitt for å forbedre kvaliteten på forberedelse, merking og imaging parametere. Dette nye systemet er egnet for analyse av farmakologisk og mekanisk-indusert opptak og utslipp av disse viktige fargestoffer i lansettformede terminaler i både villtype og genmodifiserte dyr. Eksempler på regulerende innflytelse på produktet og intensitet er gitt.
Mechanosensory nerveendene er vanligvis små, diffust utbredt og vanskelig tilgjengelig på stedet, som de vanligvis er begravd dypt i huden eller andre omkringliggende vev. Visualisere dem, derfor vanligvis krever seksjonering etterfulgt av en langvarig immunolabeling / flekker periode, eller forsinkelsen og utgiftene med å skaffe mus linjer med genetiske uttrykket av fluorescerende etiketter som grønn eller gul fluoriserende protein (GFP / YFP) 1. Her viser vi en praktisk vev og en rask og enkel metode for å få tilgang til et stort antall hårsekken afferente for å studere, og hvordan de kan raskt merket for optisk overvåkning av terminalfunksjon 2. Med praksis, kan hele teknikken fra disseksjon til bildebehandling være ferdig i så lite som to timer.
De lansettformede terminalene på sensoriske aksoner innervating hårsekkene hos pattedyr danner palisader rundt epitel av hår-follicle, med hverterminal klemt mellom glial / Schwann celle behandler 2-4. Hensikten med terminalene er å detektere mekanisk forskyvning av hårene de omgir. De er en blanding av hurtig og sakte tilpasning avslutninger, men de hovedsakelig produserer små pakker med aktivitetsnivået til håret bevegelse. Vanligvis stopper avfyring meget raskt når bevegelsen opphører, selv i nærvær av fortsatt forskyvning.
Denne murine pinna modell for å studere lansettformete terminaler ved hjelp av optiske fremgangsmåter har mange fordelaktige trekk for å studere strukturen og funksjonen til disse avslutninger. Øremuslingen er hovedsakelig to lag av huden apposed rygg mot rygg, med bare en liten mengde av mellom bruskvev. Huden er meget tynn og lett dissekert på grunn av minimale mengder av svakt lim bindevev i forhold til andre deler av kroppen. De lett skilles hudlagene, derfor gir god tilgang til follikler og terminaler. den innervasjoner lett tilgjengelig og identifiserbare. Hårsekkene blir mer spredt fordelt enn i andre hud regioner, legge til rette for avbildning av enkeltpersoner eller små grupper av follikler. Den tynne underliggende dermal lag gir god tilgjengelighet til fargestoffer og farmakologiske stoffer, så er ideell for avbildning av fluorescens mikroskopi uten videre behandling. Den avbildning av merket terminaler kan enten være av levende terminaler eller, hvis du bruker en fikses fargestoff analog, etter fiksering og videre histologisk behandling.
Vi har brukt dette preparatet for å vise at membranen resirkulering oppstår i lansettformede avslutninger, dokumentert av opptak (endocytose) og slipp (eksocytose) av en styryl pyridinium fargestoff (FM1-43 N – (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) pyridinium dibromide). Fargestoffet ikke, men synes å betydelig merke investere Schwann cellulære prosessene to. Vi har også vist at dette farveopptaks / frigjøring, og følgelig membran reCycling, er underlagt glutamatergic modulering gjennom en atypisk (fosfolipase D-koblet) metabotrope glutamatreseptoren. Resultatene av enkle stimulering og analyseprotokoller er illustrert, og vanlige potensielle analyse problemer er også markert.
Bewick og Betz opprinnelig utviklet N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) pyridinium-dibromid-relaterte styryl pyridinium fargestoffer 7-10 for å overvåke lokal gjenvinning av synaptisk vesikkelmembranen. Dye opptak, og dermed økt fluorescens, gjenspeiler derfor synaptisk vesikkelmembranen intern (endocytose). Senere denne internalisert fargestoff kan bli re-utgitt av ytterligere elektrisk aktivitet, viser fargestoff tap overvåker vesikkelmembranen eksternalisering (eksocytose). I synapser, er dette en proxy for nevrotransmitter sekresjon. Samtidig, også fant vi disse fargestoffer merke primære mechanosensory nerveender 7. Mer nylig 11, Bewick, banker og kolleger viste at dette gjenspeiler en tilsvarende prosess i modne, differensierte mechanosensory terminaler ex vivo. Her igjen, fargestoffer merke 50 nm diameter 'synaptiske lignende' vesikler (Leverandører av ett språk) som resirkulerer konstitutivt å frigjøre glutamat.I mechanosensory terminaler, i motsetning til sine synaptiske kolleger, dette er resirkulering primært spontan. Det er også modulert ved hjelp av mekanisk, snarere enn bare elektrisk, stimulering.
For sensoriske nevroner i kultur og i cochlea hårceller, styryl fargestoffer generelt og styryl pyridinium fargestoff spesielt har vist seg å passere gjennom mechanosensory kanalene, blokkerer mechanosensory kanaler og irreversibelt merking interne membraner 12. Men på sammenlign styryl fargestoff konsentrasjoner i differensierte mechanosensory terminaler i situ, som her i lansettformede avslutninger 2, eller i Ia avslutninger i muskel spindler 11, og i hårcellene som ikke er mekanisk stimuleres 13, 14, er merking av membran endocytose. I mechanosensory nerveterminaler, for eksempel, er merking reversible og ikke blokkere mechanosensory responser ved de konsentrasjoner som er brukt her 2, 11, 15. Mens noen fargestoff intern etter kanal gjennomtrengning i disse avslutninger ikke kan utelukkes helt, nær total destain med latrotoxin indikerer det store flertallet av merkingen i modne terminaler er av intern med resirkulering vesikkel membran. Vi har derfor brukt denne teknikken til å studere aktiviteten avhengighet 11 og, sist, farmakologi 2 av SLV gjenvinning i mechanosensory afferente terminaler ved å undersøke virkninger av rusmidler på opptak og utslipp av fargestoffer.
Som med de fleste praktiske teknikker krever reproduserbarhet repetisjon og praksis. Noen av de viktigste punktene for å sikre pålitelighet vil nå bli diskutert. Lansettformede merking i yngre dyr er mer pålitelig – den minste dyr vi har brukt var 15 g kroppsvekt. Det er ikke helt klart hvorfor dette er tilfelle, men det kan være på grunn disseksjon av den yngre bindevev krever mindre mekanisk trauma og leaves mindre gjenværende rester når du fjerner vev overliggende innervasjon laget.
Totalt sett er vevet forberedelse ganske enkelt, med peeling huden lagene fra hverandre er den mest teknisk utfordrende praktiske aspektet og da bare i eldre mus. I disse, hudlagene holder seg sterkt sammen ved bunnen hvor disseksjon starter, men selv her separering av lagene blir mye enklere mot margen. Heldigvis, eller kanskje derfor disse tynnere marginale hudområder vanligvis gi den mest tilfredsstillende merking, som gjør anterior huden generelt. Derfor spesielt unngå å ta tak i meget tynne huden på marginene. For å minimalisere risikoen for skade, manipulere preparater indirekte ved å presse med lukkede tang i stedet for å gripe direkte, eller hvis vesentlig gripe bare seigt bindevev lite egnet til å bli merket. Være grundig i å fjerne den "arket polystyren" lag umiddelbart liggende follikler, da dette er hoved megmekaniske hindring for bildebehandling og narkotika tilgang. Det er imidlertid viktig å minimalisere fysisk kontakt med underliggende strukturer som dette skader (dvs. strimler bort) nevrale nettverk og terminaler like nedenfor. Dersom den dominerende fluorescens er gul / hvit i talgkjertlene, fremtredende auto-fluorescens av håret baser og noen halvmåner av oransje / gul lansettformede avslutninger, indikerer dette nerve plexus laget og forbundet lansettformede terminalene har blitt fjernet i løpet av klaring. Dette ser ut til å være hovedproblemet med eldre (> 30 g) mus. Gjennom flekker prosedyrer, sikre at alt er ved 30 ° C og oksygenrikt. Vær oppmerksom på at merkede terminaler er fortsatt i live. Følgelig vil fargestoff bli utskilt av pågående spontan (konstituerende) exocytic utgivelse. Dette vil være tregere på R / T, men det er god praksis å minimalisere forsinkelsen mellom fjerning av kelator løsning og bildebehandling, for å minimere farge tap. Videre, for mellom-grupper sammenlignings studies av intensitet, er det viktig å sikre avbildning av alle grupper er tids matchet. Anvendelse av et fargestoff-chelateringsmiddel før avbilding i stor grad forbedrer bildekontrast. Så, mens relativt dyrt, er chelation trinnet ganske viktig for å sikre god bildekvalitet. Chelator anvendelse kan minimaliseres ved å gjenbruke oppløsningen flere ganger, og til og med på 2 – 3 påfølgende dager, når den lagres ved 4 ° C mellom hver bruk. Kast chelator løsning når det går merkbart rosa, viser sin fargestoff lagring nærmer seg metning.
Under avbildning, være klar over potensialet for fototoksisk skade på disse levende klemmene, som er en kumulativ resultat av både intensiteten og eksponeringstiden av eksitasjonslyset. Dette hensynet er mindre viktig for enkeltendepunktet bilder, der bildekvalitet er den primære bekymring. Imidlertid er det avgjørende ved gjentatt avbildning i kinetikkstudier for å redusere eksitasjonslys eksponering til et minimum. Mens utvikle disse fargestoffer tillabel synapser, fant vi eksitasjon for> 1 min på full effekt eksitasjon belysning vil føre til dramatisk og uopprettelig skade på nerveender. De først deretter utvide enormt, og deretter bryte helt sammen over en periode på ~ 15 min. Vi har ikke systematisk teste de relative bidrag fra eksponeringstid og intensitet, men disse observasjonene tyder på det styrende prinsippet bør være å redusere begge. Så er det anbefalt at eksitasjonslys intensitet og varighet er minimum i samsvar med å få gode bilder, og egnede kontroll bilder blir tatt i tidskurs studier. For å teste at dataene ikke er påvirket av fototoksisitet etter gjentatte bildeforhold på hvert tidspunkt ta et ekstra bilde av en tidligere usett terminal. Dette for å sikre oppførselen til merking i naive terminaler ligner den i follikler som avbildes gjentatte ganger.
En rekke faktorer kan redusere innen-gruppe variasjonen av netto intensitet data. Nøyaktig plassering av Rois, spesielt bakgrunnen ROI, er viktig, som selv små områder av upassende flekker i stor grad kan påvirke mellom-hårsekken data variabilitet. Variasjonen i netto intensitet er også påvirket av hvor fullstendig hver hårsekken er omkranset av palisade av avslutninger. Sammenlign for eksempel den halvmåneformede merking fordeling i figur 1B med nesten sirkelformet mønster vist på figur 2. Mer kompleks analyse, kanskje ved hjelp av automatisert programvare deteksjon og terskelverdier, er nødvendig hvis graden av omring er en aktuell parameter. Vær oppmerksom på at intensitetsfordelingene for selv de mest presist analyserte hårsekken gruppene ikke er normalfordelt (se figur 3), nødvendiggjør bruk av ikke-parametrisk statistikk for mellom-behandling sammenligninger av befolknings median i stedet for midler. Normaliserings teknikker, slik som uttrykker intensiteter som en prosentandel of kontralaterale kontroll, eller av en kontrollgruppe består av flere preparater, kan anvendes for ytterligere å redusere variabilitet. Den endelige tekniske elementet som skal vurderes er eksperimentell design for farmakologisk testing. I løpet av farmakologiske undersøkelser, pre-inkuberes ved fremstillingen i medikamentløsningen i 30 minutter før påføring fargestoff. Deretter opprettmedikamentkonsentrasjonen i fargestoffoppløsningen. I kontroller, bruke enten saltvann eller, hvis stoffet er oppløst i et kjøretøy, saltløsning pluss kjøretøy.
Denne artikkelen viser hvordan denne nye pinna forberedelse tilbyr kvalitet bilder av mechanosensory avslutninger høy i huden med minimal forberedelse. Vi viser også at den kan brukes til å undersøke farmakologi av to viktige aspekter av vesikkel resirkulering. Vi viser først at en glutamat reseptor agonist kan øke fargestoff intern (en markør for endocytose), og andre, er at fargestoff tapte igjen med latrotoxin (et sentralstimulerende av eksocytose). Betydningen av denne forberedelse;ion og teknikken er at den tilbyr utmerket tilgang til levende hud mechanosenory terminaler in situ for bildebehandling eksperimenter, affording unike muligheter for optisk overvåkning av terminal funksjon, struktur og deres relasjonene. Til dette siste slutt, har vi også utviklet den videre til bruk i kombinert optisk / elektrofysiologiske studier (se søster Jove artikkelen for detaljer).
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet ble finansiert av britiske Medical Research Council prosjektstøtte G0601253 til GSB og RWB og en SULSA Bioskape tilskudd til GSB
PDMS – Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera – basic model | |
Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |