Isolamento e caratterizzazione di singole cellule da embrioni di zebrafish

Summary

Questo protocollo descrive un metodo per isolare singole cellule da embrioni di zebrafish, arricchimento per cellule di interesse, catturare cellule di zebrafish in sistemi multiplex a singola cellula basati su microfluidica e valutare l'espressione genica da singole cellule.

Abstract

Il pesce zebra (Danio rerio) è un potente organismo modello per studiare lo sviluppo dei vertebrati. Sebbene molti aspetti dello sviluppo embrionale del pesce zebra siano stati descritti a livello morfologico, poco si sa sulle basi molecolari dei cambiamenti cellulari che si verificano durante lo sviluppo dell'organismo. Con i recenti progressi nella microfluidica e nelle tecnologie di multiplexing, è ora possibile caratterizzare l'espressione genica in singole cellule. Ciò consente di studiare l'eterogeneità tra le singole cellule di specifiche popolazioni cellulari per identificare e classificare i sottotipi cellulari, caratterizzare gli stati intermedi che si verificano durante la differenziazione cellulare ed esplorare le risposte cellulari differenziali agli stimoli. Questo studio descrive un protocollo per isolare singole cellule vitali da embrioni di zebrafish per saggi di multiplexing ad alto rendimento. Questo metodo può essere rapidamente applicato a qualsiasi tipo di cellula embrionale di zebrafish con marcatori fluorescenti. Un'estensione di questo metodo può essere utilizzata anche in combinazione con tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento per caratterizzare completamente il trascrittoma di singole cellule. A riprova del principio, l'abbondanza relativa dei marcatori di differenziazione cardiaca è stata valutata in singole cellule isolate derivate da progenitori cardiaci positivi per nkx2.5. Attraverso la valutazione dell'espressione genica a livello di singola cellula e in un singolo punto temporale, i dati supportano un modello in cui i progenitori cardiaci coesistono con la progenie differenziante. Il metodo e il flusso di lavoro qui descritti sono ampiamente applicabili alla comunità di ricerca del pesce zebra, richiedendo solo una linea di pesce transgenica etichettata e l'accesso alle tecnologie microfluidiche.

Introduction

La maggior parte degli studi in corso di biologia cellulare e molecolare si basano sulle medie della popolazione. Tuttavia, importanti eventi biologici possono essere mascherati da queste analisi tradizionali basati sulla popolazione dal momento che le popolazioni minori possono giocare un ruolo importante nei processi biologici e l'esito della malattia. Comprendere l'espressione genica in popolazioni eterogenee a livello di singola cellula può (e deve) portare a dati biologici e clinici rilevanti ^1,2. Di interesse per gli studi di sviluppo embrionale, in un numero maggiore di cellule, le cellule progenitrici sono spesso sottorappresentati, il che ....

Protocol

Questo protocollo richiede l'utilizzo di vivo, zebrafish adulto per la produzione di embrioni. Gli embrioni vengono raccolti per la raccolta dei tessuti. E 'essenziale per ottenere l'approvazione da etici appropriati revisione schede per condurre questo esperimento.

1. Ottenere embrioni graduali

1. Il giorno prima dell'esperimento, preparare sano, zebrafish adulti per la riproduzione. Inserire un maschio e una femmina su lati opposti di una netta barriera in un serbatoio di allevamento.
2. Ripetere 1.1 a molti vasche di allevamento come necessari per la produzione di embrioni sufficiente per l'applicazio....

Results

Come prova di principio, l'espressione del gene è stata valutata per esplorare le dinamiche di differenziazione durante lo sviluppo cardiaco. In zebrafish, i progenitori cardiaci derivano da una popolazione mesoderma di cellule che migrano verso il mesoderma piastra laterale anteriore dove si fondono per formare il tubo cuore lineare. Prima della fusione, i progenitori cardiaci iniziare ad esprimere il fattore di trascrizione Nkx2.5 (NK2 homeobox 5), che è pensato per essere il .......

Discussion

Il metodo qui descritto utilizza espressione di una proteina fluorescente sotto il controllo di un promotore specifico tipo cellulare per arricchire una popolazione di cellule progenitrici cardiache da embrioni di zebrafish per l'uso nel sistema di assistita acquisizione singola cella microfluidica per valutare l'espressione di un sottogruppo di geni cardiaci nei singola cellule. A condizione che le capacità FACS eccitazione laser e di emissione sono compatibili con il fluoroforo (s) di scelta, questo metodo può.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies
Dumont #5 pinze	Fine Science Tools	11254-20	Per rimuovere il corion dagli embrioni Provetta
microcentrifuga 2 ml	GeneMate	C-3261-1
Filtro cellulare da 40 um	Biobasic	SP104151
piatto di coltura da 35 mm	Falcon	351008
I tubi FACS sormontati da un filtro cellulare da 35 um	Falcon	352235
P1000 e punte	Rainin	17005089
P20 e punte	Rainin	17005091
protocollo del produttore di chip IFC	Fluidigm	100-6117	Versione 100-6117 E1 è stato utilizzato in un esperimento rappresentativo
Pippette in vetro pastuer a foro largo	VWR	14673-010	per trasferimento di embrioni
Pesce zebra adulto di tipo selvatico	N/A		Abbiamo usato la linea AB
Pesce zebra transgenico adulto	N/A		Abbiamo usato Tg(nkx2.5:ZsYellow)
Name	Company	Numero di catalogo	Comments
Reagenti per la dissociazione cellulare
Acqua distillata doppia	N/A
Instant Ocean Sea Salt	Instant Ocean	SS15-10
NaCl	FisherScientific	S271-3	fare brodo in acqua e utilizzare per il tampone de-yolking
KCl	Sigma	Aldrich P5405	fare stock in acqua e utilizzare per il de-yolking buffer
NaHCO3	Sigma Aldrich	S6014	fare brodo in acqua e utilizzare per il tampone di de-yolking
Leibovitz's L-15	Gibco	21083-027
FBS	FisherScientific	03-600-511	Inattivare il calore; qualsiasi marca di FBS dovrebbe andare bene
Reagente di dissociazione cellulare 1 -TrypLE	Life Technologies	12605-010	Conservare a temperatura ambiente.
Reagente per dissociazione cellulare 2 - FACSmax	Genlantis	T200100	Store -20; scongelare con ghiaccio; portare a temperatura ambiente prima dell'uso
pronasi (opzionale)	Colorante Sigma	P5147
L/D - Sytox Blue	Life Technologies	S34857	Qualsiasi colorante vivo/morto adatto alla citometria a flusso funzionerà
Trypan Blue	Gibco	15250-061
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Reagenti per l'uso su piastre IFC e qRT-PCR
Sonde specifiche per			Le sonde variano in base all'esperimento
TaqMan Probe ef1a	Life Technologies	Dr03432748_m1
TaqMan Probe gata4	Life Technologies	Dr03443262_g1
TaqMan Probe nk2-5	Life Technologies	Dr03074126_m1
TaqMan Probe myl7	Life Technologies	Dr03105700_m1
TaqMan Probe vmhc	Life Technologies	Dr03431136_m1
TaqMan Probe isl1	Life Technologies	Dr03425734_m1
TaqMan Gene Expression Master Mix	Life Technologies	4369016
Reagenti elencati nel protocollo
Kit di reagenti C1	Fluidigm	100-5319	Reagenti per il caricamento di cellule su piastra IFC
Ambion Single Cell-to-CTTM	Life Technologies		4458237 Reagenti per fasi di trascrizione inversa e pre-amplificazione
Biologia molecolare Acqua di qualità	Corning	46-000CM
C1 IFC per PreAmp (5-10 um)	Fluidigm	100-5757	Piastra IFC per piccole cellule
Name	Company	Numero di catalogo	Comments
>Equipment
Macchina C1 AutoPrep	Fluidigm	100-5477	Per l'emocitometro per uso su piastra IFC
	Sigma Aldrich	Z359629	Per il conteggio delle cellule e la valutazione delle dimensioni delle cellule
Microscopio			Per la rimozione di embrioni dal chorion
		colture tissutali	Per la valutazione della digestione di singole cellule
Macchina			Per l'isolamento di cellule di interesse