هنا نقدم بروتوكول للكشف عن مكتبة sgRNA heptamer من نوع العقاقير العلاجية المحتملة ضد سرطان الدم.
إسكات الجينات الحقيقي (وهو ما يسمى بعد TR Nase Z L – ش tilizing ه إسكات الجينات fficacious) هي واحدة من الجين الموجه RNA إسكات تكنولوجيات، والتي تستخدم على دليل صغير الاصطناعي RNA (sgRNA) لتوجيه الحمض الريبي النووي النقال 3 'endoribonuclease المعالجة، tRNase Z L ، إلى التعرف على الحمض النووي الريبي الهدف. sgRNAs يمكن تناولها عن طريق الخلايا دون أي الكواشف ترنسفكأيشن ويمكن downregulate مستويات الحمض النووي الريبي الهدف و / أو تحفز الخلايا في الخلايا السرطانية البشرية. قمنا بترتيب مكتبة sgRNA تحتوي على 156 sgRNAs heptamer من نوع للتأثير على قابلية الورم النخاعي وسرطان الدم خلايا الإنسان، ووجد أن 20 منهم يمكن أن تحفز كفاءة الخلايا في واحد على الأقل من خطوط الخلايا السرطانية. هنا نقدم بروتوكول للكشف عن مكتبة sgRNA heptamer من نوع العقاقير العلاجية المحتملة ضد سرطان الدم. ويتضمن البروتوكول كيفية بناء المكتبة sgRNA، وكيفية تقييم تأثير كل sgRNA على بقاء الخلية، وكيفية فوrther تقييم sgRNAs فعالية عن طريق التدفق الخلوي. ومن المتوقع أن يتم الحصول عليها عن طريق فحص مكتبة sgRNA على نطاق واسع يتألف من 16،384 heptamers حوالي 2،000 الزيارات.
إسكات الجينات الحقيقي (وهو ما يسمى بعد TR Nase Z L – ش tilizing ه إسكات الجينات fficacious) هي واحدة من التقنيات إسكات الجينات الموجهة RNA 1. تم عرض هذه التكنولوجيا المتقدمة على أساس خصائص tRNase Z L (أو 3 'tRNase)، الحمض الريبي النووي النقال 3' endoribonuclease المعالجة: يمكن أن يلتصق أي RNA الهدف في أي موقع من المتوقع تحت إشراف دليل الحمض النووي الريبي الصغيرة الاصطناعي (sgRNA) من خلال الاعتراف قبل الحمض الريبي النووي النقال مثل أو الجزئي قبل الحمض الريبي النووي النقال مثل هيكل تشكلت بين الحمض النووي الريبي الهدف وsgRNA 2-9. sgRNA، التي عادة ما تكون 7-31 الإقليم الشمالي في طول، يتم تصنيفها إلى أربع مجموعات، 5'-نصف الحمض الريبي النووي النقال، RNA heptamer، 14-الإقليم الشمالي الخطية RNA، والجيش الملكي النيبالي هوك.
لقد أثبتت فعالية إسكات الجينات الحقيقي من خلال تقديم مختلف sgRNAs مصممة بشكل مصطنع في الخلايا الحية 10-15. لقد أظهرنا أيضا أن sgRNAs يمكن تناولها من قبل خلايا وايthout أي الكواشف ترنسفكأيشن ويمكن downregulate مستويات الحمض النووي الريبي الهدف و / أو حث موت الخلايا المبرمج في الخلايا السرطانية البشرية 16-18. يبدو إسكات الجينات الحقيقي للعمل على داخل والجينات بين الخلايا نظام الشبكة التنظيمية عبر tRNase Z L وsgRNAs الطبيعية 19-21.
لقد شيدت مكتبة sgRNA تحتوي على 156 sgRNAs heptamer من نوع للبحث عن إمكانية sgRNAs heptamer من نوع العلاجية لسرطان الدم 22. لقد عرض الفيلم للتأثير على قابلية الورم النخاعي وسرطان الدم خلايا الإنسان، ووجد أن 20 منهم يمكن أن تحفز كفاءة الخلايا في واحد على الأقل من خطوط الخلايا السرطانية. وثبت 4 منهم للحد من معدلات نمو الورم في التجارب الماوس طعم أجنبي.
هنا نقدم بروتوكول للكشف عن مكتبة sgRNA heptamer من نوع العقاقير العلاجية المحتملة ضد سرطان الدم. ويتضمن البروتوكول كيفلبناء مكتبة sgRNA، وكيفية تقييم تأثير كل sgRNA على بقاء الخلية، وكيفية مواصلة تقييم sgRNAs فعالية عن طريق التدفق الخلوي. تحليل لالرنا الهدف الخلوية sgRNA وتقييم sgRNAs فعالية في نماذج طعم أجنبي الماوس يمكن أن يؤديها وفقا للأساليب التقليدية 17،22، على الرغم من أن هذه ليست مدرجة في هذا البروتوكول.
In most cases, fully 2′-O-methylated, 5′- and 3′-phosphorylated heptamer-type sgRNAs dissolved in water-for-injection-grade water (in the concentration of 100 µM) appear to be stable at below -20 °C for at least one year, judging from their activity to induce apoptosis in cancer cells. However, their stability would change depending on their sequence, quality, and purity. In some cases, 5′- or 3′-phosphate of a part of sgRNA molecules appears to be removed spontaneously du…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل برنامج نقل قابل للتكيف والتكنولوجيا سلس من خلال R & D، اليابانية للعلوم والتكنولوجيا وكالة، وصندوق دعم البحث العلمي في العلوم من مؤسسة تشجيع والمساعدة المتبادلة للمدارس الخاصة من اليابان مدفوعة الهدف، وأرقام JSPS KAKENHI غرانت 24300342 و15H04313 .
Custom heptamer RNA | Nippon Bioservice | ||
OligoSep Prep HC Cartridge | Transgenomic | 99-3860 | |
Water-for-injection-grade Water | Otsuka Pharmaceutical | 7131400A2129 | |
RPMI-1640 medium | Wako | 189-02025 | |
Fetal Bovine Serum | SIGMA-ALDRICH | 172012-500ML | |
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
96 Well Plate | Greiner Bio-one | 655 180 | |
Cell Counting Kit-8 | DOJINDO | 343-07623 | WST-8 solution |
Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R | TEKAN | 510-82851 | |
FACS Round-Bottom Tube | BD Falcon | 60819-820 | |
Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | P7059-1L | |
PE Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 51-66121E | |
PE Annexin V | BD Biosciences | 51-65875X | |
7AAD | SIGMA-ALDRICH | A9400-1MG | |
Flow Cytometer, FACSCalibur | BD Biosciences | 342973 |