TRUE silenziamento genico: Proiezione di un Heptamer di tipo piccolo RNA guida Library per potenziali agenti terapeutici cancro

Sommario

Qui vi presentiamo un protocollo per lo screening di una libreria sgRNA heptamer-tipo per farmaci terapeutici potenziali contro i tumori del sangue.

Abstract

TRUE silenziamento genico (chiamato dopo tR Nase Z ^L - u tilizing e fficacious silenziamento genico) è uno dei geni RNA-regia tacere tecnologie, che utilizza un artificiale piccola guida RNA (sgRNA) per guidare tRNA 3 'endoribonuclease elaborazione, tRNase Z ^L , di riconoscere un RNA bersaglio. sgRNAs possono essere presi dalle cellule senza reagenti di trasfezione e possono downregulate i loro livelli di RNA di riferimento e / o indurre l'apoptosi nelle cellule tumorali umane. Abbiamo verificato una libreria sgRNA contenente 156 heptamer tipo sgRNAs per l'effetto sulla vitalità delle cellule di mieloma e leucemia umana, e trovato che 20 di essi può efficientemente indurre apoptosi in almeno una delle linee di cellule di cancro. Qui vi presentiamo un protocollo per lo screening di una libreria sgRNA heptamer-tipo per farmaci terapeutici potenziali contro i tumori del sangue. Il protocollo comprende come costruire la libreria sgRNA, come valutare l'effetto di ogni sgRNA sulla vitalità delle cellule, e come further valutare le sgRNAs efficaci mediante citometria di flusso. Circa 2.000 colpi ci si aspetterebbe da versare lo screening della libreria sgRNA su vasta scala composta da 16.384 heptamers.

Introduzione

TRUE silenziamento genico (denominato dopo tR Nase Z ^L - u tilizing e fficacious silenziamento genico) è una delle tecnologie silenziamento genico RNA-diretto ^1. Questa tecnologia è stata sviluppata sulla base di proprietà di tRNase Z ^L (o 3 'tRNase), tRNA 3' endoribonuclease lavorazione: può fendere qualsiasi RNA bersaglio in qualsiasi luogo previsto sotto la direzione di una guida piccoli RNA artificiale (sgRNA) riconoscendo un pre-tRNA-like o micro-pre-tRNA-come struttura formata tra l'RNA bersaglio e la sgRNA ^2-9. sgRNA, che di solito è 7-31 nt di lunghezza, è class....

Protocollo

1. Costruzione di un Heptamer tipo sgRNA libreria

1. Selezionare un sottoinsieme di 16.384 (4) ⁷ sequenze 7-NT a meno che la libreria di fondo scala deve essere costruito.
   NOTA: Le sequenze possono essere casuale e / o progettati per indirizzare RNA cellulari specifici. Per questi ultimi, per strutture forcella simile al T-braccio tRNA in un RNA bersaglio con l'ausilio di un idoneo programma di computer e / o visivo, e selezionare le sequenze complementari a sequenze 7-nt immediatamente a valle delle strutture forcella ^{4,10, 17,18.}
2. Sintetizzare ciascuno dei heptamers selezionati come completamente 2'- O ....

Risultati

I sei heptamer tipo sgRNAs 5'-AUCUUCA-3 '(H1885), 5'-ACACACA-3' (H3277), 5'-GGGGGCG-3 '(H10927), 5'-GGGGCCC-3' (H10944), 5'-GCCCCCG-3 '(H12287), e 5'-CACCAGC-3' (H13260) sono stati sintetizzati chimicamente come 2'- O metil RNA contenente 5'- e 3'-fosfati.

Questi sgRNAs sono stati esaminati per gli effetti sulla vitalità di una linea cellulare di leucemia uma.......

Discussione

Nella maggior parte dei casi, gli sgRNA di tipo eptamero completamente 2'-O-metilato, 5' e 3'-fosforilato disciolti in acqua per preparazioni iniettabili (nella concentrazione di 100 μM) sembrano essere stabili al di sotto di -20 °C per almeno un anno, a giudicare dalla loro attività di indurre l'apoptosi nelle cellule tumorali. Tuttavia, la loro stabilità cambierebbe a seconda della loro sequenza, qualità e purezza. In alcuni casi, il 5'- o 3'-fosfato di una parte delle molecole di sgRNA sembra essere rimosso s.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Personalizzato eptamero RNA	Nippon Bioservice
OligoSep Prep HC cartuccia	Transgenomica	99-3860
Acqua per iniezione	Otsuka Pharmaceutical	7131400A2129
RPMI-1640 medio	Wako	189-02025
Siero fetale bovino	SIGMA-ALDRICH	172012-500ML
Penicillina-Streptomicina Soluzione	mista Nacalai Tesque	26253-84
Piastra a 96 pozzetti	Greiner Bio-one	655 Kit per conteggio cellulare a 180
	DOJINDO	343-07623	WST-8 solution
Lettore di micropiastre, Sunrise Thermo RC-R	TEKAN	510-82851
FACS Tubo a fondo tondo	BD Falcon	60819-820
Soluzione salina tamponata con fosfato	SIGMA-ALDRICH	P7059-1L
PE Annexin V Binding Buffer	BD Biosciences	51-66121E
PE Annexin V	BD Biosciences	51-65875X
Citometro a flusso 7AAD	SIGMA-ALDRICH	A9400-1MG
, FACSCalibur	BD Biosciences	342973

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