Modèle murin de Intestinal Ischémie-reperfusion
Summary
Nous décrivons ici la procédure détaillée de l'intestin d'ischémie-reperfusion chez des souris ayant entraîné des lésions reproductibles sans mortalité pour encourager la standardisation de cette technique à travers le champ. Ce modèle de l'intestin lésions d'ischémie-reperfusion peut être utilisée pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de blessures et de régénération.
Abstract
l'ischémie intestinale est une condition potentiellement mortelle associée à une large gamme de conditions cliniques, y compris l'athérosclérose, la thrombose, l'hypotension, l'entérocolite nécrosante, de l'intestin transplantation, les traumatismes et l'inflammation chronique. Intestinal lésions d'ischémie-reperfusion (IR) est une conséquence de l'ischémie mésentérique aiguë, causée par la circulation sanguine insuffisante par les vaisseaux mésentériques, entraînant des dommages intestinaux. Ischémie reperfusion suivant peut encore aggraver les dommages de l'intestin. Les mécanismes de blessure IR sont complexes et mal comprises. Par conséquent, les modèles expérimentaux animaux de petite taille sont essentiels pour la compréhension de la pathophysiologie de la blessure IR et le développement de nouvelles thérapies.
Nous décrivons ici un modèle de souris de blessure IR intestinale aiguë qui fournit une blessure reproductible de l'intestin grêle, sans mortalité. Ceci est réalisé par l'ischémie induisant dans la zone de l'iléon distal par temporellement occludineg les branches collatérales périphériques et terminales de l'artère mésentérique supérieure pendant 60 minutes en utilisant des clips microvasculaires. Reperfusion pendant 1 heure ou 2 heures après lésion entraîne une blessure reproductible de l'intestin examiné par analyse histologique. position correcte des pinces microvasculaires est critique pour la procédure. Par conséquent, le clip vidéo fournit une description détaillée visuelle étape par étape de cette technique. Ce modèle de blessure IR intestinale peut être utilisée pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de blessures et de régénération.
Introduction
L'intestin est très sensible à l'interruption de la circulation sanguine ce qui provoque l'ischémie et l'épithélium endommagé. Reperfusion après une ischémie fournit re-oxygénation du tissu, et peut promouvoir davantage la pathologie. Par conséquent, une ischémie et une lésion de reperfusion intestinale est associée à une large gamme de pathologies, y compris l' entérocolite nécrosante, le rejet d' allogreffe dans une transplantation de l' intestin, les complications de la chirurgie de l' aorte abdominale d' un anévrisme, un pontage cardiopulmonaire et 1,2 inflammatoire de la maladie de l' intestin. Lésion intestinale IR, l' ischémie mésentérique particulièrement aigu, est une condition mortelle résultant de la morbidité et de la mortalité 3.
Bien que mal compris, intestinale ischémie-reperfusion (IR) blessure est pensé pour être associée à des changements dans le microbiote intestinal ainsi que la production d'espèces réactives de l' oxygène et des cytokines inflammatoires et des chimiokines 1,4-6. Cela conduit à une activation à la fois ennate et les mécanismes immunitaires adaptatives qui favorisent l' inflammation et les tissus des blessures 1,7,8.
Les modèles animaux sont essentiels à la compréhension des mécanismes de blessure IR, car ils permettent facile et intensité forte des expériences génétiques perte de fonction. Plusieurs modèles animaux de IR ont été développés qui comprennent l' occlusion vasculaire complète, faible ischémie d'écoulement, et segmenté occlusion vasculaire (résumé dans un examen complet récente 9). L' ischémie intestinale causée par une occlusion vasculaire complète de l' artère mésentérique supérieure (SMA) est un modèle simple et couramment utilisé IR chez les grands animaux et les rongeurs 9-11. Cependant, les différentes zones de l'intestin ont une sensibilité différente à la blessure. En outre, la diversité des anesthésiques, des analgésiques, des techniques d'occlusion de l'artère, ainsi que des incohérences dans la durée de la lésion ischémique et le résultat de la récupération à des degrés variables de blessures confondant notre compréhension de la biologie de l'IR à travers studie multipless. Le tableau 1 montre ces incohérences dans les études IR murins. Le plus grand inconvénient d'utiliser les temps ischémiques plus courtes (30-45 min) vise la fenêtre de rétablissement sur lequel des différences perceptibles entre les cas et les contrôles peuvent être observés. blessure légère à l'épithélium peut être résolu d'une heure après reperfusion, par conséquent spécialisée métriques pathologiques peuvent être nécessaires pour trouver des différences dans la restitution épithéliale. En revanche, des dommages excessifs, comme on le voit en 100 min d'une lésion ischémique peut entraîner la denudement complète de l'épithélium, lorsque la restitution ne peut plus, en augmentant le taux de mortalité, et le temps de récupération. Par conséquent, nous décrivons ici la procédure détaillée de IR intestinale chez des souris ayant entraîné des lésions reproductibles sans mortalité pour encourager la standardisation de cette technique dans notre domaine. Ce modèle de blessure IR intestinale peut être utilisée pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de blessures et de régénération.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le développement de modèles de souris de blessures IR intestinale ont grandement amélioré la compréhension des mécanismes de la lésion tissulaire et aidé dans le développement de stratégies thérapeutiques potentielles pour minimiser les dommages des tissus 7,9,11,34. Les étapes essentielles de ce protocole sont un bon positionnement des clips microvasculaires, bon timing de l'évaluation de l'ischémie et histologiques appropriée des blessures IR.
La durée de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation russe des sciences, accorder aucune. 14-50-00060 et LLC RUSCHEMBIO. Ce travail a également été soutenue par le Crohn et la colite Foundation of America accorde 294.083 (AVT), et par le NIH subvention RO1 DK47700 (CJ).
Materials
| Heated Pad | Sunbeam | E12107-819 | Alternative: Braintree Scientific heated pad |
| Table top research anesthesia Machine | Vasco | UCAP 0001-0000171 | Alternative: Parkland Scientific, V3000PS |
| Nose Cone | Parkland Scientific | ARES500 | |
| Scavenger canister and replacement cartridge | Parkland Scientific | 80000, 80120 | |
| Induction Chamber | Surgivet | V711802 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | Controlled substance, contact IACUC |
| Animal clipper | Oster | Oster Golden A5 078005-050-003 | |
| Ophthalmic ointment | Webster | 8804604 | |
| Buprenorphine | McKesson | 562766 | Controlled substance,contact IACUC |
| Ketaset (Ketamine HCl) | Pfizer | NADA 45-290 | Controlled substance, contact IACUC |
| Cotton tips | Puritan medical products | 806-WC | Autoclave before use |
| Betadine | Purdue Products | 67618-150-17 | 10% Povidone-Iodine |
| Sterile saline solution | Aspen | 46066-807-60 | Adjust to room temperature before use |
| Sterile cotton gauze pad | Fisher Healthcare | 22-415-468 | |
| Non-adherent pad prepack | Telfa | 1238 | |
| IR rodent thermometer | BIOSEB | BIO-IRB153 | |
| Micro vascular clips, 70g | Roboz Surgical | RS5424, RS5435 | Alternative: WPI 14121, for SMA occlusion |
| Micro vascular clips, 40g | Roboz Surgical | RS6472 | Alternative:WPI 14120, for collateral vessels occlusion |
| Clip applying forceps | World Precision Instruments | 14189 | Alternative: Roboz #RS-5410 or #RS-5440 |
| Gill's 3 hematoxylin | Thermo Scientific | 14-390-17 | |
| Surgical staples, Reflex 9 mm | Cell Point Scientific | 201-1000 | |
| Autoclip applier | Beckton Dickinson | 427630 | |
| Byopsy foam pad | Simport | M476-1 | |
| Tissue cassette | Fisher Healthcare | 15182701A | Histosette II combination lid and base |
| 10% buffered formalin | Fisher Scientific | 245-684 | |
| Surgical iris scissors | World Precision Instruments | 501263-G SC | Alternative: Roboz RS6816 |
| Operating scissors | World Precision Instruments | 501219-G | Alternative: Roboz RS6814 |
| Dressing forceps | Roboz Surgical | RS-5228, RS-8122 | Alternative: World Precision Instruments 1519-G |
| Heparin, endotoxin free, 300 USP units/vial, 50mg | Sigma | 2106 | |
| Reflex wound clip removing forceps | Roboz Surgical | RS-9263 | Alternative: World Precision Instruments: 500347 |
| Mice C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Stock No 0664 | |
| Telfa non-adherent dressings, 3×4, sterile | Coviden | 1050 |
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