Her beskriver vi detaljert prosedyre for intestinal iskemi-reperfusjon hos mus som resulterer i reproduserbar skade uten dødelighet for å oppmuntre til standardisering av denne teknikken på tvers av feltet. Denne modellen av intestinal ischemi-reperfusjonsskade kan benyttes for å studere de cellulære og molekylære mekanismer for skader og regenerering.
Intestinal iskemi er en livstruende tilstand som er forbundet med et bredt spekter av kliniske tilstander, inkludert aterosklerose, trombose, hypotensjon, nekrotiserende enterokolitt, tarm transplantasjon, traumer og kronisk betennelse. Intestinal ischemi-reperfusjon (IR) skade er en konsekvens av akutt mesenterisk ischemi, forårsaket av utilstrekkelig blodstrøm gjennom den mesenteriske fartøy, noe som resulterer i intestinal skade. Reperfusjon etter ischemi kan ytterligere forverre skaden av tarmen. Mekanismene for IR skade er komplekse og dårlig forstått. Derfor eksperimentelle små dyremodeller er avgjørende for forståelsen av patofysiologien av IR skade og utvikling av nye terapier.
Her beskriver vi en musemodell for akutt tarm IR skade som gir reproduserbare skade av tynntarmen uten dødelighet. Dette oppnås ved å fremkalle iskemi i området ved den distale ileum ved temporært occluding de perifere og terminal sikkerhet grener av den overlegne mesenteric arterien for 60 min ved hjelp av mikrovaskulære klipp. Reperfusjon i 1 time eller 2 timer etter skaden fører reproduserbare skade av tarmen undersøkt ved histologisk analyse. Riktig plassering av mikrovaskulære klipp er avgjørende for inngrepet. Derfor videoklippet gir en detaljert visuell trinn-for-trinn beskrivelse av denne teknikken. Denne modellen av intestinal IR skade kan bli anvendt for å studere de cellulære og molekylære mekanismer for skader og regenerering.
Tarmen er svært følsom for avbrudd av blodstrømmen som fører til iskemi og epitelskade. Reperfusjon etter ischemi gir re-oksygenering av vev, og kan ytterligere å fremme patologi. Derfor er intestinal ischemi og reperfusjon skade i forbindelse med et bredt spekter av patologier, som blant annet nekrotiserende enterokolitt, allograft avvisning i tynntarm transplantasjon, komplikasjoner ved abdominal aortaaneurisme kirurgi, kardiopulmonal bypass, og inflammatorisk tarmsykdom 1,2. Tarm IR skade, spesielt akutt mesenteric iskemi, er en livstruende tilstand som resulterer i sykelighet og dødelighet tre.
Selv om dårlig forstått, er intestinal ischemi-reperfusjon (IR) skade antas å være assosiert med endringer i tarmbakterieflora, så vel som produksjon av reaktive oksygenforbindelser og inflammatoriske cytokiner og kjemokiner 1,4-6. Dette fører til aktivering av bådeNate og adaptive immunmekanismer som fremmer inflammasjon og vevsskade 1,7,8.
Dyremodeller er avgjørende for å forstå mekanismene for IR skader, som de tillater enkel gevinst-og tap-av-funksjon genetiske eksperimenter. Flere dyremodeller av IR har blitt utviklet som inkluderer komplett vaskulær okklusjon, lav vannføring iskemi, og segmentert vaskulær okklusjon (oppsummert i en fersk omfattende gjennomgang 9). Intestinal iskemi forårsaket av komplett vaskulær okklusjon av superior mesenteric arterie (SMA) er en enkel og mye brukt modell for IR i store dyr og gnagere 9-11. Men forskjellige områder av tarmen har forskjellig følsomhet overfor skade. I tillegg har variert utvalg av bedøvelsesmidler, smertestillende midler, arterie okklusjon teknikker, samt inkonsekvens i varigheten av iskemisk skade og utvinning resultat i varierende grader av skade konfunderende vår forståelse av biologi IR tvers av flere studies. Tabell 1 viser disse uoverensstemmelser i murine IR studier. Den største ulempen av å bruke kortere iskemiske ganger (30-45 min) er rettet mot vinduet for utvinning hvorpå merkbar forskjell mellom saker og kontroller kan observeres. Mild skade på epitel kan løses en time etter reperfusjon, derfor spesialisert patologiske beregninger kan være nødvendig for å finne forskjeller i epitel restitusjon. I motsetning til dette, overdreven skade, som vist ved 100 min av iskemisk skade kan resultere i fullstendig denudement av epitel, hvor gjenopprettelse er ikke lenger mulig, noe som øker dødeligheten, og utvinning tid. Derfor, her beskriver vi detaljert prosedyre for tarm IR hos mus som resulterer i reproduserbar skade uten dødelighet for å oppmuntre til standardisering av denne teknikken over vårt felt. Denne modellen av intestinal IR skade kan bli anvendt for å studere de cellulære og molekylære mekanismer for skader og regenerering.
Utviklingen av musemodeller av tarm IR skade har kraftig forbedret forståelse av mekanismene for vevskade og hjulpet i utviklingen av potensielle terapeutiske strategier for å minimere vevskader 7,9,11,34. De kritiske trinnene i denne protokollen er riktig plassering av mikrovaskulære klipp, riktig timing av iskemi og riktig histologisk evaluering av IR skade.
Varigheten av ischemi er kritisk for påfølgende epitelskade. Den typiske tiden som kreves for å indusere reproduserb…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av russiske Science Foundation, gi no. 14-50-00060 og LLC RUSCHEMBIO. Dette arbeidet ble også støttet av stiftelsen Crohn`s og kolitt of America gir 294 083 (til AVT), og ved NIH stipend RO1 DK47700 (til CJ).
Heated Pad | Sunbeam | E12107-819 | Alternative: Braintree Scientific heated pad |
Table top research anesthesia Machine | Vasco | UCAP 0001-0000171 | Alternative: Parkland Scientific, V3000PS |
Nose Cone | Parkland Scientific | ARES500 | |
Scavenger canister and replacement cartridge | Parkland Scientific | 80000, 80120 | |
Induction Chamber | Surgivet | V711802 | |
Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | Controlled substance, contact IACUC |
Animal clipper | Oster | Oster Golden A5 078005-050-003 | |
Ophthalmic ointment | Webster | 8804604 | |
Buprenorphine | McKesson | 562766 | Controlled substance,contact IACUC |
Ketaset (Ketamine HCl) | Pfizer | NADA 45-290 | Controlled substance, contact IACUC |
Cotton tips | Puritan medical products | 806-WC | Autoclave before use |
Betadine | Purdue Products | 67618-150-17 | 10% Povidone-Iodine |
Sterile saline solution | Aspen | 46066-807-60 | Adjust to room temperature before use |
Sterile cotton gauze pad | Fisher Healthcare | 22-415-468 | |
Non-adherent pad prepack | Telfa | 1238 | |
IR rodent thermometer | BIOSEB | BIO-IRB153 | |
Micro vascular clips, 70g | Roboz Surgical | RS5424, RS5435 | Alternative: WPI 14121, for SMA occlusion |
Micro vascular clips, 40g | Roboz Surgical | RS6472 | Alternative:WPI 14120, for collateral vessels occlusion |
Clip applying forceps | World Precision Instruments | 14189 | Alternative: Roboz #RS-5410 or #RS-5440 |
Gill's 3 hematoxylin | Thermo Scientific | 14-390-17 | |
Surgical staples, Reflex 9 mm | Cell Point Scientific | 201-1000 | |
Autoclip applier | Beckton Dickinson | 427630 | |
Byopsy foam pad | Simport | M476-1 | |
Tissue cassette | Fisher Healthcare | 15182701A | Histosette II combination lid and base |
10% buffered formalin | Fisher Scientific | 245-684 | |
Surgical iris scissors | World Precision Instruments | 501263-G SC | Alternative: Roboz RS6816 |
Operating scissors | World Precision Instruments | 501219-G | Alternative: Roboz RS6814 |
Dressing forceps | Roboz Surgical | RS-5228, RS-8122 | Alternative: World Precision Instruments 1519-G |
Heparin, endotoxin free, 300 USP units/vial, 50mg | Sigma | 2106 | |
Reflex wound clip removing forceps | Roboz Surgical | RS-9263 | Alternative: World Precision Instruments: 500347 |
Mice C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Stock No 0664 | |
Telfa non-adherent dressings, 3×4, sterile | Coviden | 1050 |