Murine modell av intestinal iskemi-reperfusjon Injury

Summary

Her beskriver vi detaljert prosedyre for intestinal iskemi-reperfusjon hos mus som resulterer i reproduserbar skade uten dødelighet for å oppmuntre til standardisering av denne teknikken på tvers av feltet. Denne modellen av intestinal ischemi-reperfusjonsskade kan benyttes for å studere de cellulære og molekylære mekanismer for skader og regenerering.

Abstract

Intestinal iskemi er en livstruende tilstand som er forbundet med et bredt spekter av kliniske tilstander, inkludert aterosklerose, trombose, hypotensjon, nekrotiserende enterokolitt, tarm transplantasjon, traumer og kronisk betennelse. Intestinal ischemi-reperfusjon (IR) skade er en konsekvens av akutt mesenterisk ischemi, forårsaket av utilstrekkelig blodstrøm gjennom den mesenteriske fartøy, noe som resulterer i intestinal skade. Reperfusjon etter ischemi kan ytterligere forverre skaden av tarmen. Mekanismene for IR skade er komplekse og dårlig forstått. Derfor eksperimentelle små dyremodeller er avgjørende for forståelsen av patofysiologien av IR skade og utvikling av nye terapier.

Her beskriver vi en musemodell for akutt tarm IR skade som gir reproduserbare skade av tynntarmen uten dødelighet. Dette oppnås ved å fremkalle iskemi i området ved den distale ileum ved temporært occluding de perifere og terminal sikkerhet grener av den overlegne mesenteric arterien for 60 min ved hjelp av mikrovaskulære klipp. Reperfusjon i 1 time eller 2 timer etter skaden fører reproduserbare skade av tarmen undersøkt ved histologisk analyse. Riktig plassering av mikrovaskulære klipp er avgjørende for inngrepet. Derfor videoklippet gir en detaljert visuell trinn-for-trinn beskrivelse av denne teknikken. Denne modellen av intestinal IR skade kan bli anvendt for å studere de cellulære og molekylære mekanismer for skader og regenerering.

Introduction

Tarmen er svært følsom for avbrudd av blodstrømmen som fører til iskemi og epitelskade. Reperfusjon etter ischemi gir re-oksygenering av vev, og kan ytterligere å fremme patologi. Derfor er intestinal ischemi og reperfusjon skade i forbindelse med et bredt spekter av patologier, som blant annet nekrotiserende enterokolitt, allograft avvisning i tynntarm transplantasjon, komplikasjoner ved abdominal aortaaneurisme kirurgi, kardiopulmonal bypass, og inflammatorisk tarmsykdom ^1,2. Tarm IR skade, spesielt akutt mesenteric iskemi, er en livstruende tilstand som resulterer i sykelighet og dødelighet ^tre.

Selv om dårlig forstått, er intestinal ischemi-reperfusjon (IR) skade antas å være assosiert med endringer i tarmbakterieflora, så vel som produksjon av reaktive oksygenforbindelser og inflammatoriske cytokiner og kjemokiner ^1,4-6. Dette fører til aktivering av bådeNate og adaptive immunmekanismer som fremmer inflammasjon og vevsskade ^1,7,8.

Dyremodeller er avgjørende for å forstå mekanismene for IR skader, som de tillater enkel gevinst-og tap-av-funksjon genetiske eksperimenter. Flere dyremodeller av IR har blitt utviklet som inkluderer komplett vaskulær okklusjon, lav vannføring iskemi, og segmentert vaskulær okklusjon (oppsummert i en fersk omfattende gjennomgang ^9). Intestinal iskemi forårsaket av komplett vaskulær okklusjon av superior mesenteric arterie (SMA) er en enkel og mye brukt modell for IR i store dyr og gnagere ^9-11. Men forskjellige områder av tarmen har forskjellig følsomhet overfor skade. I tillegg har variert utvalg av bedøvelsesmidler, smertestillende midler, arterie okklusjon teknikker, samt inkonsekvens i varigheten av iskemisk skade og utvinning resultat i varierende grader av skade konfunderende vår forståelse av biologi IR tvers av flere studies. Tabell 1 viser disse uoverensstemmelser i murine IR studier. Den største ulempen av å bruke kortere iskemiske ganger (30-45 min) er rettet mot vinduet for utvinning hvorpå merkbar forskjell mellom saker og kontroller kan observeres. Mild skade på epitel kan løses en time etter reperfusjon, derfor spesialisert patologiske beregninger kan være nødvendig for å finne forskjeller i epitel restitusjon. I motsetning til dette, overdreven skade, som vist ved 100 min av iskemisk skade kan resultere i fullstendig denudement av epitel, hvor gjenopprettelse er ikke lenger mulig, noe som øker dødeligheten, og utvinning tid. Derfor, her beskriver vi detaljert prosedyre for tarm IR hos mus som resulterer i reproduserbar skade uten dødelighet for å oppmuntre til standardisering av denne teknikken over vårt felt. Denne modellen av intestinal IR skade kan bli anvendt for å studere de cellulære og molekylære mekanismer for skader og regenerering.

Protocol

Dyrestudier ble utført i henhold til National Institute of Health retningslinjer og ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité i Trudeau Institute. 8-12 uker gamle C57BL / 6 mus ble anvendt for undersøkelsen. 1. Forberedelse til kirurgi Forbered og sterilisere kirurgiske instrumenter. Forbered isofluran basert anestesi system med nesen membran, og oppvarmet pad. Pass på at oppvarmet puten ikke er overopphetet (<39 ° C). Kontroller at isofl…

Representative Results

Vi optimalisert den eksperimentelle protokollen for IR kirurgi for å oppnå reproduserbare IR-indusert skade av ileum hos mus. Representative Resultatene er vist i denne delen. Figur 1 viser eksempler på mikrovaskulære klipp posisjon for å indusere iskemi av ileum. Svarte pilene viser plasseringen av de viktigste klippene tygg første ordens grener av overlegen mesenteric arterie. Grønne pilene viser posi…

Discussion

Utviklingen av musemodeller av tarm IR skade har kraftig forbedret forståelse av mekanismene for vevskade og hjulpet i utviklingen av potensielle terapeutiske strategier for å minimere vevskader ^7,9,11,34. De kritiske trinnene i denne protokollen er riktig plassering av mikrovaskulære klipp, riktig timing av iskemi og riktig histologisk evaluering av IR skade.

Varigheten av ischemi er kritisk for påfølgende epitelskade. Den typiske tiden som kreves for å indusere reproduserb…

Materials

Heated Pad	Sunbeam	E12107-819	Alternative: Braintree Scientific heated pad
Table top research anesthesia Machine	Vasco	UCAP 0001-0000171	Alternative: Parkland Scientific, V3000PS
Nose Cone	Parkland Scientific	ARES500
Scavenger canister and replacement cartridge	Parkland Scientific	80000, 80120
Induction Chamber	Surgivet	V711802
Isoflurane	Piramal Healthcare	NDC 66794-013-10	Controlled substance, contact IACUC
Animal clipper	Oster	Oster Golden A5 078005-050-003
Ophthalmic ointment	Webster	8804604
Buprenorphine	McKesson	562766	Controlled substance,contact IACUC
Ketaset (Ketamine HCl)	Pfizer	NADA 45-290	Controlled substance, contact IACUC
Cotton tips	Puritan medical products	806-WC	Autoclave before use
Betadine	Purdue Products	67618-150-17	10% Povidone-Iodine
Sterile saline solution	Aspen	46066-807-60	Adjust to room temperature before use
Sterile cotton gauze pad	Fisher Healthcare	22-415-468
Non-adherent pad prepack	Telfa	1238
IR rodent thermometer	BIOSEB	BIO-IRB153
Micro vascular clips, 70g	Roboz Surgical	RS5424, RS5435	Alternative: WPI 14121, for SMA occlusion
Micro vascular clips, 40g	Roboz Surgical	RS6472	Alternative:WPI 14120, for collateral vessels occlusion
Clip applying forceps	World Precision Instruments	14189	Alternative: Roboz #RS-5410 or  #RS-5440
Gill's 3 hematoxylin	Thermo Scientific	14-390-17
Surgical staples, Reflex 9 mm	Cell Point Scientific	201-1000
Autoclip applier	Beckton Dickinson	427630
Byopsy foam pad	Simport	M476-1
Tissue cassette	Fisher Healthcare	15182701A	Histosette II combination lid and base
10% buffered formalin	Fisher Scientific	245-684
Surgical iris scissors	World Precision Instruments	501263-G SC	Alternative: Roboz RS6816
Operating scissors	World Precision Instruments	501219-G	Alternative: Roboz RS6814
Dressing forceps	Roboz Surgical	RS-5228, RS-8122	Alternative: World Precision Instruments 1519-G
Heparin, endotoxin free, 300 USP units/vial, 50mg	Sigma	2106
Reflex wound clip removing forceps	Roboz Surgical	RS-9263	Alternative: World Precision Instruments: 500347
Mice C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	Stock No 0664
Telfa non-adherent dressings, 3×4, sterile	Coviden	1050