Individuazione di condizioni critiche per Immunostaining nel pisello afide embrioni: l'aumento del tessuto Permeabilità e diminuire la colorazione di fondo

Summary

Viene presentato un protocollo di immunocolorazione a montaggio intero su embrioni di afidi, in cui vengono affrontate le condizioni critiche per ridurre la colorazione di fondo e aumentare la permeabilità tissutale. Queste condizioni sono state sviluppate specificamente per il rilevamento efficace dell'espressione proteica nei tessuti embrionali degli afidi.

Abstract

Il Acyrthosiphon pisum pisello afide, con un genoma sequenziato e abbondante plasticità fenotipica, è diventata un modello emergente per studi di genomica e di sviluppo. Come altri afidi, Un. Pisum propagarsi rapidamente tramite riproduzione vivipara partenogenetica, dove gli embrioni si sviluppano all'interno di camere d'uovo in maniera catena di montaggio nel ovariole. In precedenza abbiamo stabilito una solida piattaforma di tutto il montaggio ibridazione in situ che consente il rilevamento di espressione di mRNA negli embrioni afidi. Per analizzare l'espressione della proteina, però, i protocolli stabiliti per immunocolorazione i ovarioli di afidi vivipari asessuati non ha prodotto risultati soddisfacenti. Qui riportiamo condizioni ottimizzate per aumentare la permeabilità dei tessuti e la diminuzione colorazione di fondo, entrambi i quali erano i problemi quando l'applicazione di approcci consolidati. Ottimizzazioni includono: (1) incubazione di proteasi K (1 mg / ml, 10 min), che è stato trovato f essenzialeo la penetrazione degli anticorpi negli embrioni metà e in fase avanzata di afidi; (2) la sostituzione di siero normale di capra / albumina sierica bovina con un reagente bloccante fornito da un digossigenina (DIG) a base di tamponamento impostato e (3) l'applicazione di metanolo piuttosto perossido di idrogeno (H _{2 O 2)} per candeggio perossidasi endogena; che ha ridotto in modo significativo la colorazione di fondo nei tessuti afidi. Queste condizioni critiche ottimizzate per immunostaining permetteranno efficace rilevazione dei prodotti genici negli embrioni di A. Pisum e altri afidi.

Introduction

Gli afidi sono insetti hemipteran con piccoli (1-10 mm) corpi morbidi. Si nutrono di piante succhiando linfa floema con apparato boccale di piercing. Inoltre, si basano su un batterio endosimbiontica obbligato, Buchnera aphidicola, per sintetizzare aminoacidi essenziali che sono carenti nella dieta linfa floematica. Afidi hanno una storia di vita complesso che comprende partenogenetica riproduzione vivipara durante la primavera e l'estate fotoperiodo lungo il giorno e sessuale riproduzione ovipara innescato dal fotoperiodo breve-day, durante il quale essi definite un numero limitato di uova svernanti ^1,2. In primavera queste ....

Protocol

1. Cultura di Afidi

NOTA:. Il ceppo di laboratorio del partenogenetica vivipara pisello afide Un pisum sono stati originariamente raccolti nel centro di Taiwan ed è stato allevato su piante ospiti (sativum giardino di piselli Pisum o fava favino) sotto-giorno lungo fotoperiodo per più di 300 generazioni (una generazione: ~ 10 giorni).

1. Germinazione dei semi
   1. Mettere a bagno i semi di piante ospiti in acqua di rubinetto per 3-5 giorni a temperatura ambiente. Riempire con acqua fresca una volta al giorno.
      NOTA: In alternativa, mettendo semi di piante ospiti direttamente nel terreno umido può ....

Results

In questo studio, abbiamo eseguito tutto il monte-immunocolorazione sugli embrioni di afidi pisello asessuati (Figura 1A). Queste femmine producono prole per partenogenesi e vivipare. Questi embrioni di sesso femminile si sviluppano all'interno di camere d'uovo dei tubuli ovariche (ovarioli) (Figura 1B e Figura 2A). Prima di microscopia, i ovarioli sezionato sono gli obiettivi di colorazione; tuttavia, è necessaria la se.......

Discussion

Abbiamo identificato condizioni ottimali critiche dell'immunocolorazione successo nel pisello afide A. Pisum, un organismo modello emergente per studi di genomica e di sviluppo ^3,15. Condizioni ottimizzate per aumentare la permeabilità dei tessuti e ridurre la colorazione di fondo migliorato l'intensità e la specificità dei segnali. Si differenziano dai protocolli standard per immunocolorazione in altri modelli animali nei passaggi per la creazione di pori nella membrana cellulare e .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% di idrogeno perxidasi (H2O2)	Sigma-Aldrich	18304	Per lo sbiancamento della perossidasi endogena degli embrioni.
4' 6-diamidino-2-fenil-indolo dicloridrato (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	Per l'etichettatura del DNA a doppio filamento. TOSSICO. Indossare guanti, erogare in piccole aliquote e tassare per ridurre al minimo l'esposizione
4D9 anticorpo monoclonale di topo anti-ingrailed/invected	sullo sviluppo banca degli ibridomi	AB_528224	Per etichettare i segmenti in via di sviluppo dell'embrione.
Anticorpo policlonale di coniglio ApVas1	Il nostro laboratorio	N/A	Per la marcatura della proteina Vas1 specifica della linea germinale dell'afide negli embrioni. Questo anticorpo è stato prodotto dal nostro laboratorio.
Austerlitz Spilli per insetti	ENTOMORAVIA	N/A	Per separare ogni camera dell'uovo da un ovariolo. Taglia 000, SMALTATO NERO.
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8	Per bloccare il legame non specifico degli anticorpi.
Fotocamera collegata al microscopio composto	Canon	EOS 5D	Per la fotografia di embrioni di afidi.
Vassoio colorimetrico 8 celle	Kartell Labware	357	Per lo sviluppo del segnale di colorazione degli embrioni di afidi. Diametro 95 x 57 mm, profondità cella 2 mm.
Microscopio composto con ottica DIC Leica	Microsystems	DMR	Per la fotografia di embrioni di afidi montati sui vetrini.
Set di tamponi DIG Wash and Block	Sigma-Aldrich (Roche)	11585762001	Per bloccare il legame non specifico degli anticorpi. Abbiamo diluito la soluzione bloccante 10x in 1x come reagente bloccante.
Pinze	Ideal-tek	N/A	Per la dissezione delle ovaie dagli afidi. Codice produttore n. 5: 5 SA.
Contagocce in vetro	N/A	N/A	Per il trasferimento di ovaie di afidi dalla piastra di splot alle provette. 150 mm di lunghezza totale e 5 3/4" di lunghezza della punta.
Glicerolo	Sigma-Aldrich	G5516	Per la pulizia degli embrioni di afidi e il montaggio.
Glycine	Bioshop	N/A	Per bloccare l'attività enzimatica della proteinasi K (PK).
Capra anti-topo IgG coniugato Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11017	Per il rilevamento di anticorpi primari dal topo.
Capra anti-coniglio IgG coniugato Alexa Fluor 633	Invitrogen	A21072	Per il rilevamento di anticorpi primari dal coniglio.
Intelli mixer	ELMI apparecchiature da laboratorio	RM-2M	Per migliorare la reazione dei reagenti con le ovaie.
Microscopia confocale a scansione laser	Leica Microsystems	SP5	Per la fotografia di embrioni di afidi montati sui vetrini con tag florecente.
metanolo	Burdick e Jackson	AH2304	Per lo sbiancamento della perossidasi endogena degli embrioni.
Vetrini per microscopio	Thermo scientific	10143560	Per il montaggio di embrioni. Bordi rettificati SUPERFROST, ca./env. 76 x 26 mm.
Occhiali di copertura per microscopio	Marienfeld	0101030	Per il montaggio di embrioni sui vetrini. Dimensioni 18 x 18 mm. Spessore n. 1 (da 0,13 a 0,16 mm)
Occhiali di copertura per microscopio	Marienfeld	0101050	Per il montaggio di embrioni sui vetrini. Dimensioni 22 x 22 mm. Spessore n. 1 (da 0,13 a 0,16 mm)
anticorpo monoclonale di topo anti-alfaTubulina (DM1A)	Santa Cruz Biotechnology	sc-32293	Per l'etichettatura della distribuzione dell'alfa-tubulina delle cellule.
Smalto per unghie	N/A	N/A	Per sigillare i vetrini coprioggetti sui vetrini.
Siero di capra normale (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	Per bloccare il legame non specifico degli anticorpi.
Paraformaldeide (PFA)	VWR	MK262159	Per la fissazione delle ovaie degli afidi.
Phalloidin-TRITC	Sigma-Aldrich	P1951	Per l'etichettatura della distribuzione di F-actina sugli embrioni.
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	N/A	N/A	Come soluzione isotonica per ovaie afidi.
Contagocce	in plastica N/A	N/A	Per il trasferimento delle ovaie degli afidi dalla provetta al vassoio cellulare. Formato 3 ml.
Proteinasi K	Merck	124678	Per creare pori (punzonatura) sulla membrana cellulare e facilitare l'accesso degli anticorpi.
Piastra spot in Pyrex	N/A	N/A	Per la dissezione e le reazioni cromatiche delle ovaie degli afidi al microscopio. Ogni cavità con diametro 22 mm e  profondità 7 mm.
SIGMAFAST 3,3'-diaminobenzidina (DAB) compresse	Sigma-Aldrich	D4168	Per lo sviluppo di segnali substrati. Chiamato anche set di compresse con substrato di perossidasi DAB.
Stereomicroscopio	Leica Microsystems	EZ4	Per la dissezione e l'osservazione delle ovaie degli afidi.
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787	Per la creazione di pori (punzonatura) sulla membrana cellulare.
VECTASHIELD Elite ABC Kit (IgG di coniglio)	Laboratori vettoriali	PK-6101	Per il miglioramento del segnale. Compresi gli anticorpi secondari IgG di capra biotinilata, i reagenti A e B.
Mezzo di montaggio VECTASHIELD	Vector laboratories	H1000	Per la pulizia di embrioni di afidi e il montaggio.