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Neuroscienze

Gleichzeitige Detektion von c-Fos Aktivierung von mesolimbischen und mesocorticalen Dopamine Belohnung Seiten Nach Naive Zucker und Fett Verschlucken in Ratten

Published: August 24, 2016
doi:
10.3791/53897

Summary

Das Ziel dieser Studie ist Belohnung bezogenen verteilten Gehirnnetzwerken zu identifizieren, indem eine zuverlässige immunhistologische Technik zelluläre c-fos-Aktivierung begrenze gleichzeitige Änderungen in Dopaminbahnen und Anschlußstellen nach neuartigen Aufnahme von Fett und Zucker in Ratten zu messen.

Abstract

In dieser Studie wird zelluläre c-fos-Aktivierung Effekte neuartiger Einnahme von Fett und Zucker auf Gehirn Dopamin (DA) Wege bei Ratten zu bewerten. Die Aufnahme von Zucker und Fette sind durch ihre angeborene Attraktionen sowie gelernt Vorlieben vermittelt. Gehirn Dopamin, insbesondere Meso-limbischen und Meso-kortikalen Projektionen aus dem ventralen Tegmentum (VTA), wurde in beiden dieser ungelernten und gelernt Antworten gebracht. Das Konzept der verteilten Netzwerken im Gehirn, wobei mehrere Standorte und Sender / Peptid-Systemen interagieren, wurde schmackhafter Nahrungsaufnahme vermitteln vorgeschlagen, aber es gibt Hinweise empirisch demonstriert solche Aktionen. So entlockt Zuckeraufnahme DA Freisetzung und erhöht c-fos-like Immunreaktivität (FLI) aus einzelnen VTA DA Projektionszonen einschließlich der Nucleus accumbens (NAC), der Amygdala (AMY) und medialen präfrontalen Kortex (mPFC) sowie die dorsale Striatum. Ferner sind diese Website zentrale Verwaltung von selektiven DA-Rezeptor-Antagonisten ins differentiell Erwerb und die Expression von konditionierten Geschmacksvorlieben von Zucker oder Fette hervorgerufen reduzieren. Ein Ansatz, mit dem zu bestimmen, ob diese Seiten als ein verteiltes Netzwerk Gehirn als Reaktion auf Zucker oder Fettaufnahme in Wechselwirkung wäre gleichzeitige beurteilen, ob die VTA und seine wichtigsten mesotelencephalic DA Projektionszonen (prälimbischen und infralimbischen mPFC, Kern und Schale der NAK, basolateralen und zentral-cortico-medialen AMY) würde sowie die dorsale Striatum koordinierte Display und gleichzeitiger FLI Aktivierung nach oraler, unkonditionierten Aufnahme von Maisöl (3,5%), Glukose (8%), Fructose (8%) und Saccharin (0,2 %) Lösungen. Dieser Ansatz ist ein erfolgreicher erster Schritt bei der Ermittlung der Machbarkeit der zellulären c-fos-Aktivierung gleichzeitig in allen relevanten Gehirn Sites mit Belohnung bezogenes Lernen in der Einnahme von schmackhafte Nahrung bei Nagetieren zu studieren.

Introduction

Gehirn Dopamin (DA) hat in zentralen Antworten auf die Aufnahme von Zucker schmackhaft durch vorgeschlagen hedonischen 1,2, Aufwand im Zusammenhang mit 3 und Gewohnheit-basierte 4,5 Wirkungsmechanismen in Verbindung gebracht. Der primäre DA Weg in diese Effekte verwickelt ihren Ursprung im ventralen Tegmentum (VTA) und Projekte auf den Nucleus accumbens (NAC) Kern und Schale, die basolaterale und zentral-cortico-medialen Amygdala (AMY) und der prälimbischen und infralimbischen medial präfrontalen Kortex (mPFC) (siehe Bewertungen 6,7). Die VTA wurde in Saccharose Aufnahme 8,9 und DA Freisetzung beobachtet folgende Aufnahme von Zucker in der NAC 10-15, AMY 16,17 und mPFC 18-20 gebracht. Fettaufnahme stimuliert auch DA NAC 21 freigeben, und eine andere DA-reiche Projektionszone der dorsalen Striatum (Nucleus caudatus-Putamen) wurde auch im Zusammenhang mit DA-vermittelten 22,23 Fütterung. Kelley 24-27 vorgeschlagen , dass diese mehrere ProjektIonenzonen dieser DA-vermittelten System gebildet , um eine integrierte und interaktive verteilte Netzwerk Gehirn durch umfangreiche und intime Verbindungen 28-34.

Zusätzlich zu der Fähigkeit der DA D1 und D2 – Rezeptor – Antagonisten Aufnahme von Zucker zu reduzieren 35-37 und Fette 38-40 hat DA Signalisierung auch in der Vermittlung der Fähigkeit von Zuckern und Fetten herzustellen konditionierten Geschmackspräferenzen (CFP) in Verbindung gebracht 41- 46. Mikroinjektionen eines DA D1 – Rezeptor – Antagonist in das NAC, AMY oder mPFC 47-49 Erwerb von GFP durch intragastric Glukose ausgelöst beseitigen. Während Mikroinjektionen von entweder DA D1 oder D2 – Rezeptor – Antagonisten in die mPFC Erwerb von Fructose-GFP 50 eliminiert werden der Erwerb und die Expression von Fructose-CFP differentiell von DA – Antagonisten in der NAC und AMY 51,52 blockiert.

Die c-fos – Technik 53,54 wurde verwendet neuronale activatio zu untersuchenn durch schmackhaft Aufnahme und neuronale Aktivierung induziert. Der Begriff "c-fos-Aktivierung" wird im gesamten Manuskript verwendet werden und wird operativ durch eine erhöhte Transkription von c-Fos während der neuronalen Depolarisation definiert. Sucrose Aufnahme erhöht fos-like Immunreaktivität (FLI) in der zentralen AMY Kern, der VTA sowie die Schale, aber nicht Kern, der NAC 55-57. Während Saccharose Aufnahme in der Sham-Fütterung Ratten signifikant erhöht FLI im AMY und der NAC, aber nicht die VTA 58, intragastric Saccharose oder Glukose – Infusionen FLI deutlich in der NAC erhöht und Mittel- und basolateralen Kernen des AMY 59,60. Wiederholte Zugabe von Saccharose zu geplanten Chow Zugang erhöht FLI im mPFC sowie der NAC Schale und Kern 61. Eine Saccharosekonzentration Herunterschalten Paradigma ergab , dass die größten FLI Erhöhungen der basolateralen AMY und NAC aufgetreten ist , aber nicht die VTA 62. Nach Anlage, Aussterben von zuckerbedingten Natur reward Verhalten erhöht FLI in der basolateralen AMY und der NAC 63. Darüber hinaus führte die Paarung Zucker Verfügbarkeit zu einem Ton in Ton anschließend 64 FLI Ebenen in der basolateralen AMY erhöht. Hochfettaufnahme erhöht auch FLI in NAC und mPFC Websites 65-67.

Die meisten der zuvor zitierten Studien untersuchten Zucker und Fett Auswirkungen auf c-fos – Aktivierung in einzelne Websites , die 24-27 Informationen über Identifikation von verteilten Gehirnnetzwerken Belohnungsbezogene nicht bieten. Des Weiteren auch viele der Studien beschreiben nicht die relativen Beiträge von Teilbereichen des NAC (Kern und Schale), AMY (basolateralen und Zentral-cortico-medial) und mPFC (prälimbischen und infralimbischen), die möglicherweise durch die geprüft werden könnten Vorteil der ausgezeichneten räumlichen, 68 Einzelzellen – Auflösung in c-Fos – Mapping. Unser Labor 69 kürzlich verwendete c-fos – Aktivierung und gleichzeitig gemessenen Veränderungen in der VTA DA – Weg und seine ProSpritz- Zonen (NAC, AMY und mPFC) nach neuen Einnahme von Fetten und Zucker in Ratten. Die vorliegende Studie, die Verfahrens und methodischen Schritte beschreibt, ob eine akute Exposition bei sechs verschiedenen Lösungen (Maisöl, Glucose, Fructose, Saccharin, Wasser und eine Fettemulsion Steuerung), differentiell FLI aktivieren in Teilbereichen des NAC, AMY würde gleichzeitig zu analysieren mPFC sowie die dorsale Striatum. Diese gleichzeitige Detektion von Unterschieden Bestätigung signifikante Auswirkungen auf FLI in jeder Site und Bestimmung, ob Änderungen in einem bestimmten Standort korrelierte mit Veränderungen in verwandten Seiten erlaubt, wodurch Unterstützung für ein verteiltes Netzwerk Gehirn 24-27. Diese geprüften Verfahren, ob der VTA, die prälimbischen und infralimbischen mPFC, Kern und Schale des NAC und der basolateralen und zentral-cortico-medialen AMY) sowie der dorsalen Striatum würde Display koordiniert und gleichzeitige FLI Aktivierung nach oraler, unbedingten Aufnahme von Glucose (8%), Fructose (8%), Maisöl (3,5%) und Saccharin (0,2%) Lösungen.

Protocol

Diese experimentellen Protokolle wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee Zertifizierung bestätigt, dass alle Themen und Verfahren sind in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für Pflege und Verwendung von Labortieren. 1. Themen Kauf und / oder Rasse männlichen Sprague-Dawley-Ratten (260-300 g). Haus Ratten einzeln in Drahtgitterkäfigen. Pflegen Sie sie auf einem 0.12 Stunden Licht / Dunkel – Zyklus mit Rattenfutter und Wasser ad libitum…

Representative Results

Alle Vertreter im Folgenden beschriebenen Ergebnisse wurden bisher 69 veröffentlicht worden sind , und werden hier wieder präsentiert "proof of concept" zu unterstützen , die Wirksamkeit der Technik in angibt. Lösung Intake Signifikante Unterschiede in Basis Saccharin Einlässe wurden für alle Tiere (F (3,108) = 57,27, p <0.001) in den ersten vier Tagen beobachtet mit Zufuhr…

Discussion

Das Ziel der Studie war es zu bestimmen, ob die Quelle (VTA) und Vorderhirns Projektionsziele (NAC, AMY, mPFC) von DA Belohnungsbezogenen Neuronen gleichzeitig nach neuen Einnahme von Fett und Zucker in Ratten aktiviert wurden, die zelluläre c-fos-Technik . Die vorliegende Studie ist eine detaillierte Beschreibung der Protokolle einer Studie bisher 69 veröffentlicht. Es wurde vermutet , dass die VTA, seine großen Projektionszonen zum prälimbischen und infralimbischen mPFC, Kern und Schale des NAC und der …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dank Diana Icaza-Culaki, Cristal Sampson und Theologia Karagiorgis für ihre harte Arbeit an diesem Projekt.

Materials

Equipment
Sprague-Dawley rats Charles River Laboratories CD-1
Wire Mesh Cages Lab Products, Seaford, DE 30-Cage rack
Rat Chow PMI Nutrition International 5001
Taut Metal Spring Lab Products, Seaford, DE n/a
Rat Weighing Scale Fisher Scientific Company n/a
Nalgene Centrifuge Tubes Lab Products, Seaford, DE 10-0501
Rubber Stopper Lab Products, Seaford, DE n/a
Metal Sippers Lab Products, Seaford, DE n/a
Saccharin Sigma Chemical Co 82385-42-0
Kool-Aid, Cherry Kool-Aid Commerical
Kool-Aid, Grape Kool-Aid Commercial
Fructose Sigma Chemical Co F0127
Glucose Sigma Chemical Co G8270
Corn Oil Mazzola Commerical
Xanthan Gum Sigma Chemical Co 11138-66-2
Sliding Microtome Microm International n/a
Neurolucida Camera MBF Bioscience Software application
Gelatin-coated Slides Fisher Scientific Company 12-550-343
Cover glass Fisher Scientific Company 12-545-M
Golden Nylon Brushes Loew-Cornell  2037
Natural Hair Sable  Loew-Cornell  2022
24 Well Plates Fisher Scientific 3527
6 Well Plates Fisher Scientific 3506
1L Pyrex bottles Fisher Scientific 1395-1L
Tissue insert (tissue strainer) Fisher Scientific 7200214
Eagle pipettes  World Precision Instruments E10 for 1-10ul 
Eagle pipettes  World Precision Instruments E100 for 20-100ul
Eagle pipettes  World Precision Instruments E200 for 50-200ul
Eagle pipettes  World Precision Instruments E1000 for 100-1000ul
Eagle pipettes  World Precision Instruments E5000 for 1000-5000ul 
Universal Tips .1-10ul World Precision Instruments 500192
Universal Tips 5-200ul World Precision Instruments 500194
Universal Tips 500-5000ul World Precision Instruments 500198
Blade Vibroslice 100 World Precision Instruments BLADE
DPX Mounting Medium  Electron Microscopy  13510
15mL centrifuge tubes Biologix Research Co. 10-0501
Slide Boxes Biologix Research Co. 41-6100
Orbital Shaker  Madell Corporation   ZD-9556
weigh boats  Fisher Scientific 02-202-100
5mL disposable pipettes Fisher Scientific 13-711-5AM
Stereo Investigator Software Micro Bright Field Software application
Name Company Catalog number Comments
Reagents
Paraformaldehyde Granular Fisher Scientific 19210
NaCl Fisher Scientific S271-1
Sodium Phophate Monobasic Fisher Scientific S468-500
Sodium Phosphate Diphasic Fisher Scientific BP332-500
Hydrogen Peroxide  Fisher Scientific H324-500
SafeClear II  Fisher Scientific 23-044-192
Methanol  Fisher Scientific A412-1
Normal Goat Serum Vector S-1000
Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L) Vector BA-1000
ABC Kit Peroxidase Standard Vector PK-4000
Anti-cFos (Ab-5) Rabbit EMD chem/Cal Biochem PC38
Triton X 100 SigmaAldrich X-100
3,3' diaminobenzidine tetra hydrochloride  SigmaAldrich D5905
Sodium Hydroxide SigmaAldrich 5881
Primary TH anti body EMD Millipore AB152
Euthosol Virbac AH
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Keywords: C-Fos ActivationMesolimbicMesocorticalDopamineRewardSugarFatIngestionVTABrainMotivationPalatable StimuliBehavioral AssaysCellular ActivationStatistical AnalysisFood RestrictionSaccharineIntake TestBrain DissectionParaformaldehydeSucrose SolutionOlfactory Bulb
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Dela Cruz, J. A. D., Coke, T., Bodnar, R. J. Simultaneous Detection of c-Fos Activation from Mesolimbic and Mesocortical Dopamine Reward Sites Following Naive Sugar and Fat Ingestion in Rats. J. Vis. Exp. (114), e53897, doi:10.3791/53897 (2016).
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