勾配遠心によるインフルエンザAウイルスキャプシドのインビトロ分解で
Summary
Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.
Abstract
Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.
Introduction
インフルエンザAウイルス（IAV）はエンベロープウイルスであり、 オルトミクソウイルス科に属します。その遺伝子は、セグメント化ネガティブセンス一本鎖RNAゲノム上にコードされています。ヒトでは、IAVは、季節の集団発生で発生する呼吸器感染症を引き起こし、世界的なパンデミック1の可能性を負いません。宿主細胞表面2上のシアル酸残基に結合すると、IAVは、クラスリン依存性エンドサイトーシスとクラスリン依存性経路3-8によって内在化されます。エンドサイトーシス液胞における酸性環境（pH値<5.5）は、ウイルスの融合および後期エンドソーム膜9の結果IAVスパイク糖タンパク質ヘマグルチニン（HA）、の主要なコンフォメーション変化を誘発します。サイトO – IAVキャプシドは、（ここではまた、ウイルス「コア」と呼ばれる）後期エンドソーム（LE）をから脱出した後、これを核に、ウイルスリボ（vRNPs）の輸送に続いて細胞質ゾルでコーティングされていませんFウイルスの複製および転写10-13。 HAの酸活性化の前に、ウイルスはその後の解体14-16のためのコアをプライムエンドサイトーシスシステム、内pHの漸減を経験します。この「プライミング」で陽子とK +10,14,16の流入を媒介するウイルス膜中のM2イオンチャネルをステップ。ウイルス内部のイオン濃度の変化は、相互作用がウイルスのマトリックスタンパク質M1と8 vRNPバンドルによって構築の妨げとなり、膜融合10,14-17以下の細胞質にIAVの脱殻を促進します。
プライミング工程の直接的かつ定量的な分析がエンドソームを実験的にアクセスすることが困難であるという事実によって妨げられてきました。エントリー方法は、さらに、非常に非同期です。また、このような放出されたウイルスRNAまたは感染力の測定値の定量RT-PCRのようなエンドポイントアッセイは、ウイルスcapsiの生化学的状態についての詳細な画像を提供していません。エントリの任意の段階で、D。 siRNAまたは薬物治療によってエンドソームの摂動が大幅IAVエントリ18-20の理解に貢献してきましたが、微調整が厳密に制御されたエンドソームの成熟プログラムで非特異的な副作用に困難となりやすいです。
これらの問題を回避するために、我々は速度勾配遠心分離17の使用に基づいて、以前に開発されたin vitroでのプロトコルを適応しています。主にタンパク質分解切断およびEM分析続く界面活性剤処理の組み合わせに基づいていた他の試み21,22、23,24、とは対照的に、このアプローチは、容易に定量化可能な結果を可能にしました。異なる傾斜層を介して遠心分離沈降粒子がに露出されることを可能にし、制御された方法で変化する条件に反応します。提示されたプロトコルでは、IAV清澄尿膜腔液または精製されたウイルス粒子に由来する二層グリセロール中に沈殿さ底部層は、非イオン性界面活性剤NP-40（ 図1）を含有する勾配。ウイルスは二、界面活性剤含有層に入ると、ウイルスの脂質エンベロープおよびエンベロープ糖タンパク質は、静かに可溶化し、残されています。コアは、8 vRNPバンドルで構成され、ペレット画分に安定な構造としてマトリックス層、堆積物に囲まれています。例えばM1およびvRNP関連核タンパク質（NP）、ウイルスコアタンパク質は、SDS-PAGEおよびクマシー染色によってペレットに同定することができます。具体的には、市販の勾配ゲルを利用して高感度コロイド状クーマシー25で染色し、高精度及びウイルスコア関連タンパク質であっても、少量の検出を可能にします。
これは、pH、塩濃度、および推定脱殻因子コア成分及びコアSTABILの沈降挙動に影響を与えるように異なる条件かどうかを試験するための基準を設定します性。この目的のために、グリセロール勾配だけ低く、界面活性剤含有層は、目的の因子または条件を導入することによって改変されます。技術は、IAVコア16の完全に異なるpH値および塩濃度の効果を調査する際に特に貴重でした。 IAVの脱殻の中間ステップは、pHが5.5と低い16,17（ 図1）でvRNP解離に続いて、弱酸性のpH（<6.5）で、マトリクス層の解離を含む監視することができます。後者のステップは、さらに後期エンドサイトーシス環境16を反映し 、グリセロール層中の高K +濃度の存在によって増強されました。したがって、ウイルスおよび勾配を通って沈降コアとして、彼らはそのエンドソームにおける模倣条件変更環境を経験しました。結果は、細胞生物学アッセイから得られた結果を補完し、in vitroでのウイルスコアの段階的分解しました。
tは">ここで紹介する方法は、高速で有効になっているとIAV（X31およびA / WSN / 33）と、IBV（B /リー/ 40）の再現性の高い分析は、酸性pHによってトリガーされ、K +16,17だけでなく、分解を増加させること脱殻アルカリ性のpH暴露17時のパラミクソウイルスのコアの。アプローチが細胞侵入時にウイルスキャプシド構造およびキャプシド解体の生化学的性質への洞察を得るために、他のエンベロープウイルスに適合させることができると考えられます。Protocol
Representative Results
Discussion
ウイルスキャプシドは、準安定巨大分子複合体です。ビリオンのアセンブリは、ウイルスゲノムのキャプシド形成及び縮合を必要とするが、感染の次のラウンドの開始は、このコンパクトなキャプシド構造の分解に依存します。ウイルスは、細胞受容体、シャペロン、タンパク質分解酵素、モータータンパク質またはヘリカーゼ、ならびにpHおよびイオンスイッチ26,27により提供され?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、試薬をご提供するため洋平山内とロベルタマンシーニに感謝します。 AHの研究室は、マリー・キュリー初期研修ネットワーク（ITN）、欧州研究会議（ERC）によると、スイス国立科学財団（Sinergia）によってサポートされていました。
Materials
| cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks |
| Glacial acetic acid | Merck Millipore | 100063 | |
| Glycerol anhydrous BioChemica | AppliChem | A1123 | |
| Hydrochloric acid | Merck Millipore | 100317 | |
| Long injection needle (21 GA, 9 cm, bevel or blunt-end) | |||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | I8896 | Now commercially available as IGEPAL® CA-630 |
| NuPAGE® 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm | Life Technologies | NP0321 | |
| NuPAGE® LDS sample buffer (4X) | Life Technologies | NP0008 | |
| NuPAGE® MOPS SDS running buffer (20X) | Life Technologies | NP0001 | |
| pH indicator strips, pH 4.0 – 7.0 | Merck Millipore | 109542 | |
| QC Colloidal Coomassie Stain | BIO RAD | 1610803 | |
| Sodium chloride | Merck Millipore | 106406 | |
| Sodiumhydroxide | Merck Millipore | 106498 | |
| Steritop™ filter unit | Merck Millipore | SCGPT05RE | |
| SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set | Beckman Coulter | 331336 | |
| Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tris hydrochloride | AppliChem | A1087 | |
| X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid | Virapur | Freshly thawed on 4°C |
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