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Articolo metodologico

In Vitro Smontaggio del virus influenzale A capsids per centrifugazione in gradiente

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DOI:

10.3791/53909

⸱

27 marzo 2016

 ,  , 
1Institute of Biochemistry, ETH Zurich, 2Department of Biochemistry, University of Zurich, 3Institute for Molecular Health Sciences, ETH Zurich

In questo articolo

Sommario

Lo smontaggio dei nuclei del virus dell'influenza A durante l'ingresso del virus nelle cellule ospiti è un processo a più fasi. Descriviamo un metodo in vitro per analizzare le prime fasi dell'uncoating virale. In questo approccio, la centrifugazione in gradiente di velocità viene utilizzata per sezionare biochimicamente le fasi che avviano l'uncoating in condizioni definite.

Abstract

I processi molecolari innescati dall'acido controllano da vicino l'ingresso cellulare di molti virus che entrano attraverso il sistema endocitico. Nel caso del virus dell'influenza A (IAV), la fusione del virus con la membrana endosomiale e il successivo disassemblaggio del capside virale, chiamato uncoating, è governato dalle condizioni ioniche all'interno delle vescicole endocitiche. Le prime fasi del ciclo di vita del virus sono difficili da studiare perché non è possibile accedere direttamente agli endosomi in via sperimentale, creando la necessità di un approccio in vitro. Qui, descriviamo un metodo basato sulla centrifugazione in gradiente di velocità di virioni purificati attraverso un gradiente di glicerolo a due strati, che consente l'analisi del nucleo IAV e della sua stabilità. Il gradiente contiene un detergente non ionico (NP-40) nel suo strato inferiore per rimuovere la membrana virale mediante solubilizzazione mentre il virus sedimenta verso il fondo. A pH neutro, i nuclei virali vengono pellettati come strutture stabili. I principali componenti principali, la proteina della matrice (M1) e le ribonucleoproteine virali (vRNP), possono essere chiaramente identificati nella frazione del pellet mediante SDS-PAGE. Diminuendo il pH a 6,0 o inferiore nello strato inferiore, si rimuove selettivamente M1 dal pellet, seguito dal rilascio di vRNP in condizioni più acide. Le bande proteiche virali su gel colorati con Coomassie possono essere sottoposte a quantificazione densitometrica per monitorare gli stati intermedi di disassemblaggio dell'IAV. Oltre al pH, è possibile valutare altri fattori che influenzano la stabilità del nucleo virale, come la concentrazione di sale e i fattori di scopertura virale putativi, semplicemente modificando di conseguenza lo strato di glicerolo contenente detergente. Nel complesso, la tecnica presentata consente un'analisi altamente riproducibile e quantitativa dell'uncoating virale in vitro. Può essere applicato ad altri virus avvolti che subiscono complessi processi di srivestimento.

Introduzione

Virus influenzale A (IAV) è un virus con involucro e appartiene alla famiglia delle Orthomyxoviridae. I suoi geni sono codificati su un segmentato, negativo-senso e di genoma a singolo filamento di RNA. Negli esseri umani, IAV provoca infezioni respiratorie, che si verificano in epidemie stagionali e porta il potenziale di pandemie globali 1. Al legame con residui di acido sialico sulla superficie della cellula ospite 2, IAV è internalizzata per endocitosi clatrina-dipendente e le vie clatrina-indipendenti 3-8. L'acido ambiente (pH <5,5) nei vacuoli endocitici innesca un importante cambiamento conformazionale della IAV picco glicoproteina emoagglutinina (HA), che si traduce in fusione del virale e la fine della membrana 9 endosomal. Una volta che il capside IAV (qui noto anche come "core" virale) è sfuggito da endosomi ritardo (LES), è non rivestito nel citosol seguito dal trasporto dei ribonucleoproteine ​​virali (vRNPs) nel nucleo - il sito oreplicazione del virus F e trascrizione 10-13. Prima all'attivazione acido HA del virus subisce una progressiva diminuzione del pH nel sistema endocitico, che innesca il nucleo per il suo successivo smontaggio 14-16. In questo "priming" passo i canali ionici M2 nella membrana virale mediare l'afflusso di protoni e K +10,14,16. La variazione della concentrazione ionica nell'interno virus disturba le interazioni costruire dal virale proteine ​​della matrice M1 e gli otto vRNP fascio, e facilita IAV uncoating nel citoplasma seguente fusione della membrana 10,14-17.

Analisi diretta e quantitativa della fase di caricamento è stata ostacolata dal fatto che endosomi sono di difficile accesso sperimentalmente. Il processo di inserimento è inoltre altamente non sincrono. Inoltre, i test end-point, come qRT-PCR di misure di RNA o di infettività virale rilasciate, non forniscono un quadro dettagliato sullo stato biochimico del Capsi viraled in qualsiasi punto di entrata. Mentre perturbazione di endosomi di siRNA o trattamento farmacologico ha contribuito in modo significativo alla comprensione della IAV ingresso 18-20, messa a punto è difficile e soggetta a effetti collaterali non specifici nel programma endosome maturazione strettamente controllato.

Per evitare questi problemi, abbiamo adattato un protocollo precedentemente sviluppato in vitro basato sull'uso di gradiente di velocità di centrifugazione 17. A differenza di altri tentativi di 21,22, 23,24, che sono stati in gran parte basati su combinazioni di taglio proteolitico e il trattamento detergente seguita da analisi EM, questo approccio ha consentito un risultato facilmente quantificabile. Centrifugazione attraverso diversi strati gradiente permette alle particelle di sedimentazione per essere esposti e reagiscono con mutevoli condizioni in modo controllato. Nel protocollo presentato, IAV derivato dal liquido allantoico chiarito o particelle virali purificate sedimentate in una glicerolo a due stratigradiente in cui lo strato inferiore contiene il detergente non ionico NP-40 (Figura 1). Come il virus entra nel secondo strato, detergenti contenenti, i lipidi busta e busta glicoproteine ​​virali sono delicatamente solubilizzate e lasciati alle spalle. Il nucleo, composto da otto vRNP fascio e circondato da uno strato di matrice, sedimenti come una struttura stabile nella frazione pellet. proteine ​​essenziali virali, quali M1 e nucleoproteina vRNP-associato (NP), possono essere identificati in pellet mediante SDS-PAGE e colorazione Coomassie. In particolare, approfittando di gel gradiente disponibili in commercio e colorazione con l'colloidale altamente sensibile Coomassie 25, permette alta precisione e rilevamento di quantità anche minime di proteine ​​essenziali associate virali.

Questo pone le basi per testare se le condizioni diverse, come il pH, la concentrazione di sale, e fattori uncoating putativi avere effetto sul comportamento di sedimentazione delle componenti di base e il nucleo stabil lità. A questo scopo, solo il strato detergenti contenenti più bassa nel gradiente di glicerolo viene modificato introducendo il fattore o condizione di interesse. La tecnica è stata particolarmente prezioso nelle indagini l'effetto di differenti valori di pH e concentrazioni saline sull'integrità del nucleo IAV 16. Passi intermedi di IAV uncoating potrebbero essere monitorati compresa dissociazione dello strato di matrice a pH leggermente acido (<6.5) seguita da vRNP dissociazione a pH 5,5 ed inferiore 16,17 (figura 1). Quest'ultima fase è stata ulteriormente potenziata dalla presenza di alta K + concentrazione nello strato di glicerolo, riflettendo un ambiente ritardo endocytic 16. Così, come il virus e il nucleo sedimentate attraverso il gradiente hanno sperimentato un ambiente che cambia che imita le condizioni in endosomi. Il risultato è stato uno smontaggio graduale del nucleo virale in vitro, integrando i risultati derivati ​​da test di biologia cellulare.

t "> Il metodo presentato qui ha permesso veloce e analisi altamente riproducibile di IAV (X31 e A / WSN / 33) e IBV (B / Lee / 40) uncoating innescato da pH acido e aumentando K +16,17 così come lo smontaggio di core paramyxovirus su esposizione pH alcalino 17. Non si può escludere che l'approccio può essere adattato ad altri virus con involucro di acquisire conoscenze in proprietà biochimiche della struttura del capside virale e capside smontaggio durante l'immissione delle cellule.

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Protocollo

1. Preparazione di Tamponi e soluzioni madre

  1. Preparare tampone MNT (20 mm MES, 30 mM Tris e 100 mm NaCl) sciogliendo 470 mg Tris cloridrato, 390 mg MES idratare e 580 mg di NaCl in 80 ml ​​di DDH 2 O. Regolare il buffer a pH 7,4 e portarlo ad un volume finale di 100 ml con DDH 2 O.
  2. Preparare tre soluzioni identiche di 500 tampone mM MES sciogliendo 9,76 g MES idrato in 80 ml ​​di dH 2 O ciascuno. Regolare i buffer a pH 5.8, 5.4 e 5.0, rispettivamente per titolazione con NaOH concentrato. Portare ogni buffer ad un volume finale di 100 ml con dH 2 O.
  3. Preparare due soluzioni identiche di 500 tampone Tris mM sciogliendo 7.88 g Tris cloridrato in 80 ml ​​dH 2 O ciascuno e regolare il pH a rispettivamente 7,4 e 6,4,, per titolazione con HCl concentrato. Portare il buffer ad un volume finale di 100 ml con dH 2 O.
  4. Preparare la soluzione di glicerolo al 50% in DH 2 O e mescolare bene fino a quando il GLYCErol è omogeneamente misto. Filtrare la soluzione attraverso un gruppo di filtraggio Steritop (0,22 micron dimensioni dei pori) in una bottiglia di vetro.
  5. Preparare soluzione al 10% NP-40 e 1 M NaCl in DH 2 O.
  6. Preparare 25x inibitore della proteasi concentrata sciogliendo due compresse in 4 ml DDH 2 O.

2. Preparazione di glicerolo gradienti

  1. Preparare 5 ml di detersivo maestro tampone mix (300 mM NaCl, 2% NP-40, 2x concentrata inibitori della proteasi) soluzione per ogni condizione di pH a prova (pH 7.4, 6.4, 5.8, 5.4, e 5.0). A questo scopo, mescolare 9 ml di 1 M NaCl, 6 ml di 10% NP-40, 2,4 ml di inibitore della proteasi archivio 25x e 9 ml DDH 2 0.
  2. Per ogni condizione di pH pipetta 4,4 ml di master mix in un tubo conico da 50 ml.
  3. Per i valori di pH superiori a 5.8 aggiungere 0,6 ml del rispettivo pH aggiustato soluzione 500 mM Tris magazzino al tubo. Per pH 5,8 ed inferiore aggiungere 0,6 ml della rispettiva soluzione stock di 500 mm MES pH modificato.
  4. Fare 5ml di soluzione tampone contenente 300 mM NaCl, inibitore della proteasi 2x, 60 mM Tris a pH 7,4 e DDH 2 O. Questo servirà come il buffer di controllo del gradiente senza detersivo.
  5. Se necessario, fine-regolare il pH delle soluzioni a pH 7.4, 6.4, 5.8, 5.4 e 5.0 aggiungendo soluzioni HCI o NaOH concentrati rispettivamente.
  6. Aggiungere 5 ml di stock di glicerolo 50% a 5 ml della miscela tampone detergenti contenenti e senza detergenti risultanti in sei diverse soluzioni di glicerolo 25%. Verificare i valori di pH utilizzando strisce indicatrici pH.
    NOTA: Nel caso in cui il pH misurato differisce significativamente dal valore desiderato, le rispettive soluzioni dovrebbero essere preparate di nuovo.
  7. Preparare la soluzione di glicerolo al 15% mescolando 50% stock di glicerolo con dH 2 O in un rapporto 3: 7.

3. Ultracentrifugazione di IAV

  1. Aggiungere 3 ml di soluzione di glicerolo al 15% in tubi centrifugazione ultra chiare (13,2 ml, 14 mm x 89 mm) utilizzando una siringa da 5 ml e una neeDLE (21 G, 9 cm di lunghezza). Non lasciare gocce alla parete interna del tubo in quanto questo potrebbe disturbare l'integrità del gradiente. Ripetere questo per un totale di sei tubi centrifugazione, uno per ciascuna delle cinque condizioni di pH per testare e uno per il campione di controllo.
  2. Posizionare con cura soluzione di glicerolo 3,4 ml di 25% sotto il livello di glicerolo 15% utilizzando una siringa da 5 ml e un lungo ago. Fare attenzione a non mescolare i due strati. Ripetere questa operazione per tutte le sei condizioni per testare con le rispettive soluzioni di glicerolo pH regolato.
    NOTA: Il lavoro in classe II biosicurezza cabinet per i seguenti passaggi.
  3. sovrapporre delicatamente i gradienti di glicerolo con 30 ml chiarito liquido allantoico contenente IAV (X31, H3N2) diluito in 1 ml MNT tampone (corrisponde a circa 20-30 mg di proteina virale totale) per ogni sfumatura.
  4. Equilibrio opposte tubi e metterli in un rotore ultracentrifugazione SW41. Centrifugare per 150 min, a 55.000 xg, e 12 ° C.
  5. Dopo la centrifugazione, accuratamenteRimuovere il surnatante, cioè, entrambi gli strati glicerolo utilizzando una pipetta Pasteur pulita e un aspiratore. Risospendere il pellet in 40 microlitri (1x) non riducenti tampone campione LDS. E 'importante pipettare su e giù più volte per sciogliere completamente il pellet. Trasferire il campione in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.

4. SDS-PAGE di pellet frazioni e Coomassie colorazione

  1. Riscaldare tutti i campioni a 95 ° C per 10 min. A questo punto i campioni possono essere conservati a -20 ° C finché non vengono analizzati mediante SDS-PAGE.
  2. Carico 20 ml di pellet disciolti SU UN gradiente di pre-cast (4-12%) mini gel Bis-Tris e corrono per 1 ora a 200 V in 1x MOPS SDS tampone di corsa.
  3. Fai la soluzione fissazione con il 40% di metanolo e acido acetico glaciale al 10% in DDH 2 O.
  4. Incubare il gel in soluzione di fissaggio per 1 ora e macchiare notte in un 15 centimetri piatto di coltura cellulare con un volume sufficiente di soluzione colloidale Coomassie mentre delicatamenteagitazione a temperatura ambiente.
    NOTA: È importante chiudere il piatto in modo da evitare l'evaporazione della soluzione colorante.
  5. Decolorare il gel in DDH 2 O. Sostituire il DDH 2 O ogni 15-20 minuti fino a quando il fondo del gel diventa chiaro. Conservare il gel in DDH 2 O a 4 ° C fino a quando non viene sottoposto a scansione per la banda quantificazione.
  6. Eseguire la scansione del gel ad alta risoluzione e di utilizzare il software disponibile o su misura commercialmente per la quantificazione di intensità di banda proteine. Sottrarre il segnale di fondo da una regione vicino alle rispettive bande e normalizzare questi valori per i campioni di controllo senza detergente (a pH 7,4).

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Risultati

Come già discusso, adescamento in endosomi è necessario per rendere il nucleo IAV uncoating competente. Protonazione del nucleo indebolisce interazione di M1 e vRNPs (composto di RNA virale, NP, e la polimerasi PB1 complesso / PB2 / PA). è iniziato questo processo quando il virus in arrivo è esposto ad un pH di 6,5 (o inferiore) in endosomi precoci (SEO) e continua fino a quando i fusibili virus in giro pH 5.0 a Les.

Per simul...

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Discussione

capsids virali sono metastabili complessi macromolecolari. Durante il montaggio del virioni richiede l'incapsidamento e condensazione del genoma del virus, l'inizio del prossimo ciclo di infezione dipende lo smontaggio di tale struttura capside compatta. I virus sono evoluti per sfruttare vari meccanismi cellulari per controllare il ciclo di verniciatura-uncoating, inclusi recettori cellulari, accompagnatori, enzimi proteolitici, forze fisiche fornite da proteine ​​motrici o helicases nonché pH e interruttori io...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo Yohei Yamauchi e Roberta Mancini per averci fornito i reagenti. Il laboratorio AH è stato sostenuto dalle reti di formazione iniziale Marie Curie (ITN), il Consiglio europeo della ricerca (CER), e dal Fondo Nazionale Svizzero (Sinergia).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
compresse per inibitori della proteasi senza EDTASigma-Aldrich11873580001La soluzione madre può essere conservata a 2-8 gradi C per 1 o 2 settimane
Acido acetico glacialeMerck Millipore100063
Glicerolo anidro BioChemicaAppliChemA1123
Acido cloridricoMerck Millipore100317
Ago per iniezione lunga (21  G, 9 cm, smussato o smussato)
MES idratoSigma-AldrichM8250
MetanoloMerck Millipore106009
NP-40Sigma-AldrichI8896Ora disponibile in commercio come IGEPAL® CA-630
NuPAGE 4-12% mini gel Bis-Tris, 10  pozzetti, 1,0 mmLife TechnologiesNP0321
NuPAGE LDS tampone per campioni (4x)Life TechnologiesNP0008
NuPAGE MOPS SDS tampone di funzionamento (20x)Life TechnologiesNP0001
Strisce indicatrici di pH, pH 4,0-7,0Merck Millipore109542
QC Colorazione colloidale per coomassieBIO RAD1610803
Sodio cloruroMerck Millipore106406
idrossido di sodioMerck Millipore106498
unità filtrante SteritopMerck MilliporeSCGPT05RE
SW41 Ti, set di rotori per ultracentrifugaBeckman Coulter331336
Thinwall, provette per centrifuga ultratrasparenti, 13.2  ml, 14 mm x 89 mmColtro di Beckman344059
Tris cloridrato AppliChemA1087
X31 Virus dell'influenza A (H3N2), uovo cresciuto, liquido allantoideo chiarificatoVirapurAppena scongelato il 4 ° E

Riferimenti

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