Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.
Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 µm) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (< 10 µm), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.
Mass spectrometry imaging (MSI) is a relatively new molecular imaging technique to provide the spatial distribution of the compounds of interest on surfaces. During the MSI analysis, mass spectrometry (MS) measurements are recorded across the surface on an individual pixel basis to create a 2D image of the species of interest 1. MSI techniques have the ability to provide a spatially resolved feature distribution for a large range of metabolites, allowing a much greater amount of information to be obtained from a sample than from using traditional molecular imaging techniques, and they have the potential to greatly improve the analysis of biological samples for biological and pharmacology studies 2. MSI can be broadly separated into non-ambient and ambient approaches. The non-ambient MSI analysis techniques, such as matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) MS 3 and time of flight secondary ion MS (ToF SIMS) 4, are capable of high spatial resolution (around 5 µm and 100 nm, respectively) and high sensitivity. However, these methods require extensive sample preparation, such as the application of matrix molecules to the sample surface, and a vacuum sampling environment, which could introduce artifacts to the data obtained. Ambient techniques such as desorption electrospray ionization (DESI) MS 5, laser ablation electrospray ionization (LAESI) MS 6, and nano-DESI MS 7 are capable of MSI of samples with little to no prior preparation under the ambient environment, which is able to produce MS images that potentially reflect the sample in its most native state. However, most of these techniques generally lack the high spatial resolution and detection sensitivity compared with the non-ambient techniques, with experiments typically conducted at around 150 µm per pixel 8.
Single cell analysis (SCA) is a growing field that has the ability to characterize the chemical composition of biological samples at the cellular level. SCA enables the analysis of biological systems at a more fundamental level than traditional cell analysis techniques, which produce an averaged result of a population of cells, potentially providing insights that are previously intractable 9. MS techniques have recently been applied to SCA (termed single cell mass spectrometry or SCMS) using non-ambient techniques such as MALDI MS 10 and ToF SIMS 11 in which cells are pretreated before analysis, and with ambient techniques such as LAESI MS 12 and direct extraction methods, such as live single-cell video-MS 13, 14, to analyze a wide variety of cell types such as egg, plant, and cancer. Ambient techniques have the advantage of being applied to live cells, which again minimizes the artifacts, leading to a better representation of the metabolites in the live cells. The direct extraction based methods described above, however, perform the sample extraction and analysis process at two different steps, which result in a time gap during the analysis that could potentially alter the metabolites present within the sample.
The single-probe, a miniaturized multifunctional device that is capable of conducting high spatial resolution ambient MSI on biological tissue sections 15 and near real-time in-situ SCMS on live single cells 16. The single-probe has an integrated construction that is made up of a pulled dual-bore quartz capillary coupled with a solvent providing inlet and a nano-ESI emitter made from fused silica capillaries, enabling solvent delivery and analyte extraction to be performed from a single device. In the ambient MSI mode, the single-probe is placed over the sample tissue and surface micro-extraction occurs, allowing a rastered MS image to be made at high spatial resolution. Particularly, the tapered tip of the single-probe is small enough to be inserted into live eukaryotic cells for in-situ SCMS analysis, where the metabolite detection takes less than two seconds between probe insertion and MS detection, allowing chemical information to be taken in near real-time. Here are the protocols to fabricate the single-probe device and to conduct both the ambient MSI and SCMS modes using the single-probe MS techniques.
Die einzelsträngige Sonde ist ein Multifunktionsgerät, das für beide MSI und SCMS-Experimente verwendet werden kann. Die Single-Sonde Setup (einschließlich Übersetzung Bühnensysteme, Mikroskope, Ionenquelle Trennstellenflansch, etc.) wird als Add-On – Komponente entwickelt , die an das bestehende Massenspektrometer flexibel angepasst werden kann. Ein schneller Austausch zwischen der Single-Sonde Setup und der herkömmlichen ESI-Ionenquelle kann innerhalb einer Minute erreicht werden. Im Prinzip die entsprechende Ionenquelle Trennstellenflansch verwendet, kann die Single-Sonde Setup auf die alle anderen Massenspektrometern angepasst werden. Zusätzlich kann die Probennahme Lösungsmittel eine Vielzahl von Reagenzien enthält, die mit dem Einzelsondenaufbau für reaktive MSI und SCMS-Experimente verwendet werden, die stark die Detektion breitere Bereiche von Biomolekülen verbessert. Neben tierischen Geweben und Zelllinien, ist die Single-Sonde ebenfalls in der Lage andere biologische Systeme wie Pflanzen analysiert. Daher kann mit dem gleichen Versuchsaufbau undähnlichen Benutzertraining kann eine Vielzahl von Studien durchgeführt werden, um ein einzelnes Instrument und durch den gleichen Benutzer, so dass für eine effiziente und vielseitige Experimente mit der minimalen Trainingszeit und Instrumentierungs Kosten erreicht werden.
Die Schlüsselkomponente des Single-Sonde MS-Technik ist die Sonde selbst. Die Qualität der Single-Sonde hat einen wesentlichen Einfluss auf die Leistung, die weitgehend die Qualität der beiden MSI und SCMS Experimente bestimmt. Bei Single-Sonden Herstellung, stellen Sie sicher, dass die Kapillaren innerhalb des Dual-Bohrung Schläuche sind sicher die Möglichkeit, Lösungsmittelleck während der Versuche zu beseitigen geklebt. Es ist wichtig, eine minimale Menge an UV-härtbarem Epoxid zu verwenden, so dass die Öffnungen und Kapillaren werden nicht während der Sondenherstellung verstopft.
Die Single-Sonde verwendet wurde 15 hoher räumlicher und Massenauflösung Umgebungs MSI auf biologischen Proben durchzuführen. Der große Vorteil der Umgebungs MSI überNicht-Umgebungs Verfahren ist , dass die Probenvorbereitung zumindest ohne die Notwendigkeit einer Vakuumprobennahme Umgebung gehalten wird, die die Probe 8 in einer nahezu nativen Zustand analysiert werden können. Eine der größten Hürden für die meisten anderen Umgebungs MSI Technik hat einen Mangel an räumlicher Auflösung 1 gewesen. Verglichen mit der Desorption basiert MSI Techniken (wie DESI und LAESI), die kleine Spitze Größe der einzelsträngigen Sonde ermöglicht eine robuste und effiziente Oberflächenflüssigkeit Mikroextraktion über einen kleinen Bereich durchgeführt werden, was zu einer hohen räumlichen Auflösung von 8,5 um, die zu den höchsten 15 Umgebungs MSI Techniken erreicht werden. Zusätzlich stellt die Komponenten der Probenahme Lösungsmittel Einstellen zusätzliche Flexibilität die Experimente durchzuführen. Beispielsweise, Probenahme Lösungsmittel enthalten Reagenzien (zB dikationische Verbindungen) wurden zur Durchführung reaktive MSI Experimenten verwendet, was eine signifikante Zunahme in der Anzahl der identifizierten Metaboliten per Experiment 20. Der andere Vorteil der einzelsträngigen Sonde ist die integrierte Konstruktion, die den Bedienungskomfort während der gesamten Datenerfassungsprozess bereitstellt. Da der Abstand zwischen der Spitze und der Gewebeoberfläche für die Ionensignalintensität und Stabilität sehr empfindlich ist, eine flache Gewebeschnitt zu erhalten und leitenden Oberflächenanpassung Abflachen des Abstandsvarianz zu minimieren, ist ein Schlüssel für hochwertige MSI Experimenten. Daraus folgt, dass die Single-Sonde MSI Techniken nicht geeignet sind, eine hohe räumliche MS Bilder von unebenen Oberflächen zu erhalten.
Neben der Bereitstellung einer qualitativ hochwertigen Sonde zu Herstellung, das Gerät sorgfältig Tuning ist essentiell für einen erfolgreichen MSI Experiment. Unter allen Abstimmungsschritte, die Anpassung der Höhe der einzelnen Sondenspitze über dem Gewebeschnitt Oberfläche ist die kritische. Wenn die Sonde Höhenverstellung, die Pumpe das Lösungsmittel Probenahme und schalten Sie die Ionisierung Spannung, so dass nur die Lösungsmittel Hintergrund Ionensignale observ sein kanned. Dann überwacht die Änderung des Massenspektrums während sorgfältig die Sondenoberflächenabstand zu reduzieren, indem die motorisierte Z-Stufe, bis starke und stabile Ionensignale von Gewebeschnitt Anheben beobachtet werden kann; diese Sondenhöhe wird für MSI Datenerfassung während des Experiments verwendet werden. Darüber hinaus ist eine optimierte Lösungsmittelflussrate für MSI Experimente notwendig. Stellen Sie die Durchflussrate mit der optimierten Sondenhöhe. Stellen Sie sicher , dass es keine Lösungsmittel Ausbreitung auf der Gewebeoberfläche ist ( das heißt, Durchflussrate zu hoch) oder Blasenbildung innerhalb des Nano-ESI – Emitter (dh Durchfluss zu niedrig ist).
Die Single-Sonde ist ein multifunktionales Gerät für die Bioanalytik. Zusätzlich zu den Experimenten MSI, ist es in der Lage nahezu in Echtzeit der Durchführung in-situ SCMS 16 detaillierte chemische Informationen vom lebenden eukaryotischen Zellen zu erläutern, was ein großer Vorteil ist , verglichen mit anderen Vakuum basierend SCMS Techniken (wie MALDI 10 und SIMS 21 </sup>). Die geringe Größe der Sondenspitze bietet die Möglichkeit, in eine lebende eukaryotische Zelle eingeführt zu werden und die intrazelluläre Verbindungen zur sofortigen MS-Analyse zu extrahieren und zu ionisieren. Ebenso können die Probenahme Lösungsmittel enthalten Reagenzien (zB dikationischer Verbindungen) in den SCMS Experimenten verwendet werden, und ein breiteres Spektrum von zellulären Bestandteile können als je zuvor in einer Live – Einzelzelle nachgewiesen werden (laufende Forschung, werden Daten nicht gezeigt). Obwohl die Echtzeit-Analyse der chemischen Profile von lebenden Einzelzellen liefert, aufgrund der Zellpenetration der Membrane und Extraktion von Zellinhalt, wird die Zelle in Untersuchung nach dem Versuch getötet werden was bedeutet, daß die einzelsträngige Sonde SCMS Technik immer noch eine destruktive Methode. Darüber hinaus kann die Sondenspitze und Nano-ESI-Emitter in der Single-Sonde leicht für unerfahrene Anwender verstopft sein. Um die Wahrscheinlichkeit von Geräteverstopfung zu reduzieren, stellen Sie sicher zu berühren den Kern zu vermeiden, wenn die Single-Sondenspitze in eine cel Einfügenl. Wenn Verstopfung auftritt, kann das Gerät durch Aufheizen der verstopften Sondenspitze oder die Nano-ESI – Emitter mit einer selbstgebauten Heizwendel 16 regeneriert werden. Eine weitere Einschränkung der einzelsträngigen Sonde SCMS – Technik ist , daß nur die Klebe Zellen (dh werden die Zellen an Oberflächen befestigt) analysiert werden können aktuelle Setup. Indem jedoch die Zellmanipulationssystem in die Einzelsonde MS gerät, breiteren Zelltypen können in Zukunft untersucht werden.
Ähnlich wie bei dem Experiment MSI, eine qualitativ hochwertige Sonde und ein optimiertes Lösungsmittelflussrate ist für SCMS Studien kritisch zu erhalten. Wenn das Lösungsmittel Flussrate Abstimmung wird die Single-Sondenspitze über die Probe gelegt (dh kein Kontakt mit der Zelle oder dem Kulturmedium), und stellen Sie sicher , dass es von der Sondenspitze oder Blasenbildung in der Nano-ESI kein Lösungsmittel tropft ist Emitters.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Dr. Laskin (the Pacific Northwest National Laboratory) for sharing the motorized stage control software and MSI visualization program. We also thank Dr. Mao (the University of Oklahoma) for providing mouse organ samples and Mr. Chad E. Cunningham (the University of Oklahoma) for the assistance in machining and electronics work. This research was supported by grants from the Research Council of the University of Oklahoma Norman Campus, the American Society for Mass Spectrometry Research Award (sponsored by Waters Corporation), Oklahoma Center for the Advancement of Science and Technology (Grant HR 14-152), and National Institutes of Health (R01GM116116).
Single-probe fabrication | |||
Dual bore quartz tubing, 1.120’’×0.005”×12” | Friedrich & Dimmock, Inc, Millville, NJ | MBT-005-020-2Q | |
Micropipette laser puller | Sutter Instrument Co., Novato, CA | Model P-2000 | |
Fused silica capillary, ID: 40µm, OD: 110µm | Molex, Lisle, IL | TSP040105 | |
UV curing resin | Prime Dental, Prime-Dent, Chicago, IL, USA | Item No. 006.030 | |
LED UV lamp | Foshan Liang Ya Dental Equipment, Guangdong, China | LY-C240 | |
Epoxy resin | Devcon, Danvers, MA | Part No. 20945 | |
Inline MicroFilter | IDEX Health & Science LLC, Lake Forest, IL | M-520 | |
Microunion | IDEX Health & Science LLC, Lake Forest, IL | M-539 | |
Microscope slide (glass) | C & A Scientific – Premiere, Manassas, VA | 9105 | |
Syringe | Hamilton, Reno, NV | 1725LTN 250UL | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mass spectrometer | |||
LTQ Orbitrap Mass sprectrometer | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | LTQ Orbitrap XL | |
Xcalibur 2.1 Software | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | XCALIBUR21 | |
Fance Stage Control | Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA | ||
MSI QuickView | Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Contact closure device | |||
USB-6009 Multifunction DAQ | National Instruments, Austin, TX | 779026-01 | |
DR-5V SDS Relay | Panasonic, Kadoma, Japan | DR-SDS-5 | |
Logic Gates 50 Ohm Line Driver | Texas Instruments, Dallas, TX | SN74128N | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Single-probe setup | |||
Motorized linear stage and controller (3 sets) | Newport, Irvine, CA | Conex-MFACC | |
Miniature XYZ stage | Newport, Irvine, CA | MT-XYZ | |
Translation XY stage | ThorLab, Newton, NJ | PT1 and PT102 | |
Thermo LTQ XL ion source interface flange | New Objective, Woburn, MA | PV5500 | |
Digital stereo microscope, 250X-2000X | Shenzhen D&F Co., Shenzhen, China | Supereyes T004 | |
USB Digital Photography Microscope | DX.com, HongKong, China | S02 25~500X | |
Syringe pump | Chemyx Inc., Stafford, TX | Nexus 3000 | |
Solid Aluminum Optical Breadboard, 8" x 8" x 1/2" | Thorlabs, Newton, NJ | MB810 | |
Flexible clamp holder | Siskiyou, Grants Pass, OR | MXB-3h | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solvents | |||
Methol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 34860 Chromasolv | |
Water | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | W4502 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 34967 Chromasolv | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture | |||
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Cellgro, Manasas, VA | 10-013-CV | |
10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Gibco/Life Technologies, Long Island, NY | 10100-139 | |
Penicillin/Streptomycin | Cellgro, Manasas, VA | 30-002-CI | |
10 mM HEPES (pH 7.4) | Cellgro, Manasas, VA | 25-060-CI | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Cellgro, Manasas, VA | 46-013-CM | |
TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 12604-013 | |
12-well plates | Corning Inc., Corning, NY | Falcon 351143 | |
T25 flask | Corning Inc., Corning, NY | Falcon 3055 | |
Micro Cover Glasses, Round, No. 1 | VWR International, Radnor, PA | 48380-046 | |
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | VWR International, Radnor, PA | BDH1115-1LP | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tissue imaging | |||
Cyro-Cut Microtome | American Optical Coporation | ||
Tissue-Tek, Optimum cutting temperature (OCT) | Sakura Finetek Inc., Torrance, CA | 4583 | |
Microscope slide (polycarbonate ) | Science Supply Solutions, Elk Grove Village, IL | P11011P |