Kullanımı Kültür düz kas hücrelerinin sarkoplazmik retikulum içinde Kalsiyum Değişiminin Ölçülmesi FRET tabanlı Konfokal Görüntüleme

Summary

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Abstract

Maintenance of steady-state calcium (Ca²⁺) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca²⁺ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca²⁺ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca²⁺-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca²⁺ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca²⁺ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca²⁺. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca²⁺ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca²⁺ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca²⁺ indicator, D1SR, is used to detect Ca²⁺ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca²⁺ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca²⁺ movement.

Introduction

Ca ^{2 +} vücuttaki her hücre içinde bolca bulunan çok önemli bir iyon olduğunu. Bu büyüme, çoğalma, göç ve apoptosis ^1-4 dahil olmak üzere birçok farklı hücresel fonksiyonları, önemli rolleri vardır. İyi Ca ^{2 +} hem doğrudan hem de dolaylı eylemlerle bu süreçleri etkileyebilir olduğunun tespit edilmesi ve bu nedenle, bu iyonun normal hücre içi konsantrasyonları değişiklikleri kolayca etkilenen hücreler için olumsuz sonuçlara neden olabilir. SR hücresinin ⁵ içinde en büyük hücre içi Ca ^{2 +} mağaza olarak kabul edilir. SR ve sitoplazma hem de Ca ²⁺ kararlı durum düzeyleri normal içine ve bu organel Ca ²⁺ -transporting kanalları dışında sürekli bir akış yoluyla korunur. Nedeniyle yaralanma ya da hastalık herhangi bir biçimde hücrelere dayatılan stresli koşullar genellikle onun üzerinde uzun süreli etkilere sahip gitmek SR Ca önemli değişiklikler ²⁺ ile ilişkiliHücrenin alth. Olguların çoğunda şiddetli, stresli bir hücrenin yetersizlik kurtarmak için ve kararlı durum SR Ca korumak ²⁺ seviyeleri bile apoptozis ^6-8 ölümle sonuçlanacak olabilir.

Hücresel Ca ^{2 +} dinamikleri güncel araştırma az sayıda çalışma testi Ca ²⁺ mağaza içeriği doğrudan ^9-11 organel gerçeği ile sınırlıdır. En yaygın uygulama yerine SR Ca ^{2 +} içerik ^12-14 değişikliklerin dolaylı ölçümleri gibi sitoplazmik Ca ^{2 +} düzeyleri ölçümü içerir. Bu deneylerde, Ca ^{2 +} yaygın organel en azalmasına neden farmakolojik ajanların (örn thapsigargin) kullanılarak SR serbest bırakılmasını indüklenir. Sonuçlar daha sonra sitoplazmik Ca ^{2 +} konsantrasyonları dalgalanmalara göre SR Ca ²⁺ değişiklikler ile ilgili çizilir. dolambaçlı ma böyle sonuçlara varmak için araştırmacılar için kalan yeteneğine rağmennner, SR Ca ²⁺ ölçüm bu yöntem toplanan verilerin yorumlanması ile ilgili birçok sınırlamalar bu bilgileri, toplamak için dolaylı yoldan açıkça. Bu açık kısıtlama atlamak için, SR lümen ağ içinde doğrudan bulundu Ca ²⁺ miktarını ölçmek için gereklidir.

Doğrudan intraluminal SR Ca ^{2 +} rekor seviyelere edememek nihai sonucu açısından hayati hücre kültürü araçları ve kullanılan Ca ^{2 +} göstergesidir. Mevcut yazıda referans veriler için, kullanılan VSMC donmuş hücre hattından gelen dikkat etmek önemlidir. Hücreler,% 5 _CO2 kaynağı ile sabit bir 37 ° C 'de kuluçkaya yatırılır Dulbecco Modifiye Eagle ortamı (DMEM) + belirtilen deneyler için geçitlerin 22-26 fazla% 10 yeni doğmuş buzağı serumu (NCS), kültürlenmiştir. Mevcut yöntem kullanılarak, örneğin, hücreler, çok başarılı bir şekilde ekstrasel- simüle eden bir protein karışımı ile yetiştirilendokuda ^15, birçok farklı türde çevre. SR Ca ven boyunca başarısı için önemli ²⁺ araştırma kullanılan protein karışımı türüdür; Bu durumda, düşük büyüme faktörü çeşitli normal Ca2 ⁺ sinyali etkileyen hareketleri sürekli olarak test edilen hücreler içinde meydana gelen bu aracın bileşenlerini önlemek için gerekliydi. Test hücrelerinin başarılı büyümenin ardından, Ca ^{2 +} göstergesi de etkin bir şekilde bu kültür hücreleri devreye sokulmalıdır. Bu SR-yerleşik Ca ²⁺ göstergesi D1SR taşıyan adenoviral bir vektör ile mümkün hale gelmiştir. Yüksek bir transfeksiyon verimliliği elde etmek için, hücreler önce, görüntüleme için en az 36-48 saat boyunca viral vektörler ile inkübe edilmesi gerekir. Bu hazırlık ca yüksek doğruluk ve tekrarlanabilirlik SR lümeninde ²⁺ geçişlerini ölçmek için güvenilir bir araç sağlar.

Bu protokolde kullanılan D1SR gösterge D1ER Ca değiştirilmiş çeşididir ²⁺ iBaşlangıçta California Üniversitesi'nden Dr. Roger Y. Tsien laboratuarında, San Diego, ABD ^9,16 tarafından oluşturulan ndicator. Orijinal D1ER önceki Ca ^{2 +} göstergelere ^9,16 oranla çok daha geniş aralık (0,5-160 uM) üzerinden Ca ²⁺ hassasiyetleri göstermek cameleons denilen genetik olarak kodlanmış Ca ^{2 +} göstergeleri ikinci nesil aittir. Yeni varyant D1SR Dr. Wayne Chen (Alberta, Kanada Üniversitesi'nden) bir tür hediye, ancak, bir mutant calsequestrin dizisi (yerine orijinal D1ER gibi bir kalretikülinden dizisi) taşır. Mutant calsequestrin bir ¹¹ lümen SR içinde Ca ^{2 +} bağlayıcı endojen calsequestrin rekabet sorununu ortadan kaldıran Ca ²⁺ bağlanma azalttı. D1SR göstergesi kesik geliştirilmiş siyan floresan proteini (OBP) ve sarı floresan protein (YFP) modifiye kalmodulin (CaM) ve M13 içeren bir bağlayıcı protein tarafından bağlanan (t taşırCaM) dizilerine bağlanan miyozin hafif zincir kinaz o 26-kalıntı peptit. CaM-M13 sekansı, endojen kalmodulin bağlanmasını M13 önlemek için modifiye edilmiştir. Ayrıca, SR tutulmasını sağlamak için, calsequestrin sekansı CFP ¹¹ 5 'ucunda eklenmiştir. ^{Ca2 +} bağlandığında, Eksantrik M13 alan FRET sinyal yoğunluğunda bir artış olarak kaydedilir yan CFP ve YFP arasında enerji transferi bir artışa neden şekilsel değişiklik geçer. ^{2 +} SR lümen Ca konsantrasyonu düştüğünde Öte yandan, Eksantrik M13 alan komşu CFP ve YFP ve FRET sinyal yoğunluğunda belirgin bir düşüş arasındaki enerji transferinde bir azalma ile sonuçlanır ters şekilsel değişiklik geçer .

Protocol

Etik deyimi: Bütün deneyler ve prosedürler British Columbia, Vancouver, Kanada Üniversitesi Laboratuvar Biyogüvenlik kurallarına anlaşma yapılmıştır. FRET tabanlı Konfokal Mikroskopi için 35 mm Cam-bottom Kültür Yemekleri hazırlanması 1. Aşağıdaki yordam 36-48 saat önce deneyler kullanarak tabak hazırlayın. C depolama ° -20 seçilen jelatinimsi protein karışımı ve% 0.25 tripsin-EDTA Al ve kullanıma kadar mobil buz banyosu içinde saklayın. NOT: Kaplama pr…

Representative Results

Bu bölüm, dolaylı sitoplazmik Ca dalgalanmaları gözlemleyerek Ca 2 + deposu konsantrasyonları organele değişiklikleri ölçmek yaygın olarak kullanılan şekilde göre SR lümen Ca2 + konsantrasyonu verilerini yakalamak için tarif edilen yöntem kullanılarak elde edilebilir sonuçlarının örneklerini içerir 2+ . Şekil 1A YFP kanal (514 nm uyarma / 535 nm emisyon)…

Discussion

Bu protokol SR lümeninde Ca ^{2 +} kavkıdaki D1SR adenovirüs ile VSMC'Ierin aktarıldığı açıklanmaktadır. Bu yöntem, doğrudan bu organel olan ^{Ca2 +} ölçümü hem de değişik kalsiyum hareket eden maddelerin uygulanmasının bir sonucu olarak SR üzerinden içindeki hareketinin / sağlar. Bu yöntem SR ve sitoplazmik Ca ^{2 +} düzeyleri değişiklikleri genel hücresel sağlığını etkiler ve nasıl bu değişiklikler birbiriyle ilişkili nasıl kapsamlı bir anlayış doğr…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate)	Life technologies	11995-065	Warm in 37°C water bath before use
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5mL	Corning	356230	Keep at -20°C until right before use
Newborn Calf Serum	Sigma-Aldrich		Keep at -20°C until right before use
35mm glass-bottomed plates	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 mL 0.2 μM vented blue plug seal cap flask	BD Falcon	353136
Trypsin/EDTA Solution	Life technologies	25200056	Keep at -20°C until right before use
50 mL Polypropylene Conical Tube	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Gift
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Keep at -20°C until right before use
1.5 mL Black Microcentrifuge Tubes	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.