Måling av kalsium svingninger i løpet av sarkoplasmatisk retikulum av dyrkede glatte muskelceller Bruke FRET basert Confocal Imaging

Summary

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Abstract

Maintenance of steady-state calcium (Ca²⁺) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca²⁺ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca²⁺ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca²⁺-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca²⁺ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca²⁺ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca²⁺. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca²⁺ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca²⁺ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca²⁺ indicator, D1SR, is used to detect Ca²⁺ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca²⁺ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca²⁺ movement.

Introduction

Ca ^{2 +} er et meget viktig ion finnes i overflod i hver eneste celle i kroppen. Den har viktige roller i mange ulike cellulære funksjoner, inkludert vekst, spredning, migrasjon, og apoptose ^1-4. Det er godt etablert at Ca2 ⁺ kan påvirke disse prosessene gjennom både direkte og indirekte handlinger, og derfor kan endringer i de vanlige intracellulære konsentrasjoner av dette ion lett resultere i negative resultater for berørte celler. SR er regnet som den største intracellulære Ca ²⁺ butikken i cellen ^fem. Steady state nivåer av Ca ²⁺ i både SR og cytoplasma er normalt vedlikeholdt gjennom konstant forandring inn i og ut av Ca ²⁺ -transporting kanaler av denne organeller. De stressende forhold pålagt celler på grunn av noen form for skade eller sykdom er ofte forbundet med betydelige endringer i SR Ca ²⁺ som går på å ha langvarige effekter på hanalth av cellen. I de mest alvorlige tilfeller av manglende evne en stresset celle gjenopprette og opprettholde stabil tilstand SR Ca ²⁺ nivåer kan også munne ut i død ved apoptose ^6-8.

Nåværende forskning på cellulære Ca ²⁺ dynamikken er begrenset av det faktum at få studier test organ Ca ²⁺ lagre innhold direkte ^9-11. Den vanligste praksisen i stedet innebærer måling av cytoplasmatiske Ca ²⁺ nivå som indirekte målinger av endringer i SR Ca ²⁺ innhold ^12-14. I disse forsøk er Ca ²⁺ vanligvis indusert til å bli frigitt fra SR ved bruk av farmakologiske midler som forårsaker organeller sin uttømming (f.eks thapsigargin). Konklusjoner blir dratt med hensyn til endringer i SR Ca ²⁺ basert på svingninger i cytoplasma Ca ²⁺ konsentrasjoner. Til tross for muligheten rester for etterforskere å trekke slike konklusjoner i en rundkjøring manner, er denne metoden for SR Ca ^{2 +} måling klart en indirekte måte for å fange opp slike opplysninger, med mange begrensninger vedrørende tolkningen av innsamlede data. For å omgå denne klar begrensning, er det nødvendig å måle mengden av Ca ²⁺ funnet direkte i SR luminal nettverket.

Avgjørende for det endelige resultat av å være i stand til direkte å ta opp intraluminale SR Ca ^{2 +} nivåene er cellekulturverktøy og Ca2 ⁺ indikator som brukes. For data som det refereres til i det aktuelle manuskript, er det viktig å merke seg at VSMCs brukt kom fra en frossen cellelinje. Celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) + 10% nyfødt kalveserum (NCS) i løpet av 22-26 passasjer for de skisserte eksperimentene, ble inkubert med en konstant 37 ° C med _5% CO2 tilførsel. Ved å bruke den aktuelle fremgangsmåten, for eksempel celler som har vært meget vellykket dyrkes på en proteinblanding som simulerer det ekstracellulæremiljø av mange forskjellige typer av vev ^15. Viktig for å lykkes langs vein av SR Ca ²⁺ forskning er en type protein blanding som brukes; i dette tilfellet, en lav vekstfaktor variasjon var nødvendig for å unngå komponenter av dette verktøyet fra å påvirke det faste Ca ²⁺ signalering og bevegelser stadig forekommer innenfor de testede cellene. Etter vellykket vekst av testceller, Ca ²⁺ indikatoren må også være effektivt introdusert til disse dyrkede celler. Dette har blitt mulig ved hjelp av en adenovirus vektor som bærer SR-bosatt Ca ²⁺ indikator D1SR. For å oppnå en høy transfeksjonseffektivitet, må cellene inkubert med virale vektorer i minst 36-48 timer før avbildning. Dette preparatet gir et pålitelig verktøy for å måle Ca ^{2 +} transienter innen SR lumen med høy nøyaktighet og reproduserbarhet.

D1SR indikator som brukes i denne protokollen er en modifisert variant av D1ER Ca ²⁺ i-indikator som opprinnelig ble skapt av Dr. Roger Tsien laboratorium ved Universitetet i California, San Diego, USA ^9,16. Den opprinnelige D1ER tilhører en andre generasjon av genetisk kodede Ca ^{2 +} indikatorer som kalles cameleons som viser Ca ²⁺ følsomheter over et mye bredere område (0,5 til 160 uM) i forhold til tidligere Ca ^{2 +} indikatorer ^9,16. Den nye varianten D1SR, en slags gave fra Dr. Wayne Chen (University of Alberta, Canada), derimot, bærer en mutant calsequestrin sekvens (i stedet for en calreticulin sekvens som i den opprinnelige D1ER). Mutant calsequestrin har en redusert binding til Ca ²⁺ som eliminerer problemet med å konkurrere med endogent calsequestrin i binding til Ca ²⁺ i SR lumen ^11. Den D1SR indikatoren bærer en avkortet forbedret cyan fluorescerende protein (CFP) og gul fluorescerende protein (YFP) som binder med en linker proteinholdig modifisert kalmodulin (CaM) og M13 (tHan 26-rest peptid av myosin-lettkjede-kinase som binder seg til cam) sekvenser. CAM-M13 sekvensen har blitt endret for å hindre M13 fra binding til endogene calmodulin. Også, for å sikre SR oppbevaring, en calsequestrin sekvens har blitt lagt på 5 'enden av CFP ^11. Når bundet til Ca ^2+, går CAM-M13 domene gjennom konformasjonsforandringer endringer som resulterer i en økning i energioverføringen mellom flanke CFP og YFP, som er ført som en økning i FRET signal intensitet. På den annen side, når konsentrasjonen av SR luminal Ca ^{2 +} synker, går CaM-M13 domene gjennom omvendte konformasjonsendringer, noe som resulterer i en reduksjon i energioverføringen mellom de flankerende CFP og YFP, og et betydelig fall i FRET signalintensitet .

Protocol

Etikk uttalelse: Alle eksperimenter og prosedyrer ble utført i samsvar med de Laboratory biosikkerhet retningslinjene fra University of British Columbia, Vancouver, Canada. 1. Utarbeidelse av 35 mm Glass-bunn Kultur Retter for FRET basert konfokalmikroskopi Forbered plater med følgende prosedyre 36-48 timer før eksperimenter. Hent valgt geléaktige proteinblanding og 0,25% trypsin-EDTA fra -20 ° C lagring og holde dem i mobile isbad inntil bruk. MERK: Belegget proteinblanding bør…

Representative Results

Denne delen inneholder eksempler på resultater som kan oppnås ved bruk av den beskrevne metode for å fange SR luminal Ca 2+ konsentrasjonsdata, sammenlignet med vanlig ansatt slags indirekte måling av endringer i organ Ca 2+ store konsentrasjoner ved å observere endringer i cytoplasma Ca 2+ . Figur 1A viser et øyeblikksbilde av en region av interesse (ROI) av SMC kultur t…

Discussion

Denne protokollen beskriver transfeksjon av VSMCs med D1SR adenovirus for å studere Ca2 ⁺ konsentrasjoner i lumen av SR. Denne metoden gjør det mulig for den direkte måling av Ca ²⁺ innenfor dette organeller, så vel som dens bevegelse inn i / ut av SR som et resultat av anvendelsen av forskjellige kalsium bevegelige midler. Denne metoden har mange fordeler for etterforskere jobber mot en helhetlig forståelse av hvordan endringer i SR og cytoplasmatiske Ca ²⁺ nivåer påvirke den gen…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate)	Life technologies	11995-065	Warm in 37°C water bath before use
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5mL	Corning	356230	Keep at -20°C until right before use
Newborn Calf Serum	Sigma-Aldrich		Keep at -20°C until right before use
35mm glass-bottomed plates	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 mL 0.2 μM vented blue plug seal cap flask	BD Falcon	353136
Trypsin/EDTA Solution	Life technologies	25200056	Keep at -20°C until right before use
50 mL Polypropylene Conical Tube	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Gift
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Keep at -20°C until right before use
1.5 mL Black Microcentrifuge Tubes	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.