Presentiamo metodi per la costruzione di elettrodi per registrare simultaneamente l'attività neurale extracellulare e rilasciare più sostanze neuroattive in prossimità dei siti di registrazione nei topi svegli. Questa tecnica consente l'analisi dettagliata di input sinaptici locali putativi al neurone di interesse.
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Articolo metodologico
Extracellulare La registrazione di un neurone attività combinata con Microiontophoretic applicazione di sostanze neuroattivi nei topi Awake
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le differenze dell'attività di neurotrasmettitori e neuromodulatori, e di conseguenza diverse risposte neurali, si può rinvenire tra animali anestetizzati e sveglio. Pertanto, i metodi che consentono la manipolazione dei sistemi sinaptiche in animali svegli sono necessari al fine di determinare il contributo degli ingressi sinaptici al trattamento neuronale influenzata da anestetici. Qui, presentiamo metodologia per la realizzazione di elettrodi per registrare simultaneamente attività neurale extracellulare e rilasciare più sostanze neuroattive in prossimità dei siti di registrazione in topi sveglio. Grazie alla combinazione di queste procedure, abbiamo effettuato iniezioni microiontophoretic di gabazine per bloccare selettivamente i recettori GABA A nei neuroni del collicolo inferiore di topi testa-trattenuto. Gabazine modificato con successo proprietà di risposta neurale come l'area risposta in frequenza e l'adattamento specifico per stimolo. Così, abbiamo dimostrato che i nostri metodi sono adatti per Recording attività singola unità e per sezionare il ruolo dei recettori del neurotrasmettitore specifici in elaborazione uditiva.
La limitazione principale della procedura descritta è il tempo di registrazione relativamente breve (~ 3 ore), che è determinato dal livello di assuefazione dell'animale alle sessioni di registrazione. D'altro canto, più sessioni di registrazione possono essere eseguite nello stesso animale. Il vantaggio di questa tecnica rispetto ad altre procedure sperimentali utilizzate per manipolare il livello della neurotrasmissione o neuromodulation (come iniezioni sistemici o l'uso di modelli optogenetic), è che l'effetto del farmaco si limita agli ingressi sinaptici locali al neurone bersaglio. Inoltre, la misura fabbricazione di elettrodi permette la regolazione di parametri specifici in base alla struttura neurale e tipo di neurone di interesse (ad esempio la resistenza suggerimento per migliorare il rapporto segnale-rumore delle registrazioni).
Introduzione
L'interazione tra l'eccitazione e l'inibizione neuronale è fondamentale per l'elaborazione delle informazioni sensoriali 1. È anche noto che l'anestesia ha un forte impatto sulla dinamica di attivazione corticale e il pattern temporale degli ingressi sinaptici 2,3. Ad esempio, è stato osservato che gli anestetici alterano la durata di risposte visivamente evocati nei neuroni corticali 3,4. Inoltre, il rapporto tra eccitatori e gli ingressi sinaptici inibitori è diverso in animali anestetizzati e svegli 4,5, alterando sia evocata e tassi di attività spontanee 6,7. Misurando le conduttanze sinap....
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Protocollo
Tutte le procedure sperimentali sono state effettuate presso l'Università di Salamanca, con l'approvazione di, e con metodi conformi alle norme del, l'Università del comitato Animal Care Salamanca, nonché le norme dell'Unione europea (direttiva 2010/63 / UE) per l'uso degli animali nella ricerca neuroscientifica.
1. elettrodi di tungsteno
Nota: La fabbricazione di elettrodi di tungsteno è basato sulla tecnica originale descritta in Merrill e Ainsworth 27 e Ainsworth et al 28 e eseguita utilizzando la configurazione workstation descritto in Bullock et al 17...
- Pe....
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Risultati
Abbiamo registrato l'attività singola unità di 4 neuroni ben isolate della IC. Tipici rapporti segnale-rumore ottenuti durante le registrazioni extracellulari in topi svegli sono mostrati in Figura 3B. Figura 4A mostra l'area risposta in frequenza (FRA) di ogni neurone prima e durante il blocco del GABA A recettori con gabazine. È stato osservato un incremento nella forza risposta (picchi / stimolo) e un ampliamento della sintonizzazio.......
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Discussione
Il microiontophoresis di sostanze neuroattivi in animali svegli è una tecnica potente per sondare e sezionare il ruolo degli ingressi sinaptici specifici per l'attività di singoli neuroni 40,41. Ancora più importante, questa procedura permette di determinare l'impatto dei neurotrasmettitori e neuromodulatori su circuiti neurali senza l'interferenza potenziale di anestetici. Qui, dimostriamo che l'applicazione gabazine nel IC di topi svegli robusta cambiato la frequenza di sintonizzazione
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo progetto è stato finanziato dalla MINECO concede BFU201343608-P e PSI2013-49348-EXP, e la concessione SA343U14 JCYL al finanziamento di base MSM e MRC di ARP. YAA tenuto una CONACYT (216106) e una borsa di studio settembre
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Filo di tungsteno | Harvard Apparatus LTD | 33-0099 | 0,005 pollici x 3 pollici |
| Capillare in vetro borosilicato | Harvard Apparatus LTD | 30-0053 | Parete standard in borosilicato senza filamento, diametro esterno 1,5 mm, diametro interno 0,86 mm, |
| capillari in vetro multibarrel | Strumenti di precisione mondiali | 5B120F-4 | Capillare a 5 barili, 4 pollici di lunghezza, 1,2 mm OD, con filamento |
| Diaplus | DiaDent | 2001-2101 | Adesivo fotopolimerizzabile, utilizzato per fissare l'elettrodo di tungsteno alla pipetta multibarile in vetro |
| G-Bond | GC Corporation | 2277 | Adesivo fotopolimerizzabile, utilizzato per fissare il palo della testa al cranio dell'animale |
| Charisma | Heraeus Kulzer | 66000087 | Composito fotopolimerizzabile, utilizzato per rafforzare il legame del palo con il cranio |
| Araldit Cristal | Ceys | 2-component expoxy, utilizzato per garantire ulteriormente l'attacco dell'elettrodo di tungsteno alla pipetta multibarrel in vetro | |
| Coperta riscaldante | Cibertec | RTC1 | |
| Telaio stereotassico | Narishige | SR-6N | Modificato per topi |
| Dispositivo microiontoforetico | Harvard Apparatus LTD | Neurophore BH-2 | Comprese le pompe per ionoforesi IP-2 (una per ogni canale di somministrazione del farmaco) e un modulo di bilancia |
| Estrattore per pipette in vetro multibarile | Narishige | Modello PE-21 | |
| Lampada LED | Technoflux | CV-215 | 5 W, 430-485 nm |
| MicroFil | World Precision Instruments | MF34G-5 | Ago in plastica flessibile, 34 AWG |
| Ketamina Imalgene | Merial | , 100 mg/mL | |
| Rompun | Bayer | Xilazina, 20 mg/mL | |
| Gabazina / SR-95531 | Sigma | S106 | Preparare ~ 1000µ l di 20 mM di gabazina in acqua distillata e regolare il pH a 4 |
Riferimenti
- Harris, K. D., Thiele, A. Cortical state and attention. Nat Rev Neurosci. 12 (9), 509-523 (2011).
- Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Effects and mechanisms of wakefulness on local cortical networks. Neuron. 69 (6), 1061-1068 (2011).
- Sellers, K. K., Bennett, D. V., Hutt, A., Williams, J.....
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Ristampe e permessi
