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Neuroscienze

覚醒マウスにおける神経活性物質のMicroiontophoreticアプリケーションと組み合わせることで神経活動の細胞外記録

Published: May 21, 2016
doi:
10.3791/53914
, , , ,
1Auditory Neuroscience Laboratory, Institute of Neuroscience of Castilla y León,University of Salamanca, 2Neural Systems Laboratory, Institute for Systems Research,University of Maryland, 3Medical Research Council Institute of Hearing Research, 4Department of Cell Biology and Pathology, Faculty of Medicine,University of Salamanca

Summary

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

Abstract

神経伝達物質および神経修飾物質、その結果、異なる神経応答の活性の違いは、麻酔をかけたと目を覚ました動物との間で見つけることができます。したがって、覚醒した動物におけるシナプスのシステムの操作を可能にする方法は、麻酔薬による影響を受けないニューロンの処理にシナプス入力の寄与を決定するために必要とされます。ここでは、同時に細胞外神経活動を記録し、覚醒マウスにおける記録部位の近傍に複数の神経活性物質を放出するための電極を構成するための方法を提示します。これらの手順を組み合わせることで、我々は選択的に頭拘束マウスの下丘のニューロンでGABA A受容体をブロックするgabazineのmicroiontophoretic注射を行いました。 Gabazineに成功し、このような周波数応答領域と刺激固有の適応などの神経応答のプロパティを変更しました。したがって、我々は我々の方法はrecordinに適していることを示していますグラムシングルユニット活動と聴覚処理中の特定の神経伝達物質受容体の役割を解剖するため。

記載された手順の主な制限は、レコーディング・セッションに動物の慣れのレベルによって決定され、比較的短い記録時間（〜3時間）、です。一方、複数の記録セッションは、同じ動物で行うことができます。 （例えば全身注射または光遺伝学モデルの使用など）、神経伝達や神経調節のレベルを操作するために使用される他の実験手順に対するこの技術の利点は、薬剤の効果は、ターゲットニューロンにローカルシナプス入力に限定されていることです。また、電極のカスタム製造は、（例えば、録画の信号対雑音比を改善するためのチップ抵抗等の）関心のニューロンの神経構造や種類に応じて、特定のパラメータの調整を可能にします。

Introduction

神経興奮と抑制の相互作用は、感覚情報1を処理するための基本です。また、麻酔は、皮質の活性化およびシナプス入力2,3の時間パターンの動態に強い影響を有することが知られています。例えば、麻酔薬は皮質ニューロン3,4における視覚誘発反応の持続時間を変化させることが観察されています。また、興奮性と抑制性シナプス入力間 ​​の比率は、両方の誘発と自発的活動率6,7を変更すること、麻酔し、覚醒した動物で4,5異なります。覚醒中に、阻害は励起よりも強かったのに対し、シナプスのコンダクタンスを測定することにより、ハイダーや同僚4は阻害が麻酔下での振幅で励起と一致したことがわかりました。これらの知見は、覚醒動物における感覚処理に関する特定のシナプス入力の影響を研究するための実験手順の開発を促します。

<Pクラス= "jove_content">（NAのオーダーの）小電流注入を適用することにより、帯電した神経活性物質の制御放出は、広くシナプス入力の寄与と感覚処理8-13で推定細胞受容体の役割を研究するために使用されてきました。 microiontophoresisと呼ばれるこの技術は、迅速かつ閉じ込め効果に寄与する記録ニューロンの近傍に薬剤の適用を可能にします。この手順は、全身注射、微小透析または光遺伝学技術の使用など、他の実験操作によって誘発される広範囲の効果と比較して、神経活性物質の局所作用を研究するために、より適しています。通常、ピギーバック電極構造14,15は、同時に標的ニューロンを記録し、関心の神経活性物質を送達するために使用されます。これは、神経活性物質を運ぶmultibarrelピペットに装着された記録電極から構成されています。 Oの修正HaveyとCaspary 14によって説明riginal手順が実施されてきました。例えば、タングステン電極の代わりにガラスの一つは、神経活動16を記録するために使用することができます。記録の要件を満たすためにタングステン線のヒント、ガラス絶縁、および先端露出の調整の電解エッチング：タングステン電極17,18の製造のための以前に公表された方法は、3つの一般的なステップを伴います。

聴覚神経科学における興味深いと緊急フィールドは、刺激固有の適応（SSA 19）の研究です。 SSAは、他の、めったに提示しない音に一般化されていない反復的な音に神経応答の特定の減少です。 SSAの重要性は、聴覚脳内の逸脱検出の基礎となる神経機構としての潜在的な役割に存在するだけでなく、聴覚の後期ミスマッチ陰性コンポーネントの可能性の神経相関は、潜在的な20,21を誘発しました。 SSA O聴覚皮質19,22-24までICからccurs。 GABA媒介阻害はまた、麻酔26の影響を受けることが示されたSSA 7,16,25の利得制御機構として作用することが実証されています。ここでは、前と覚醒したマウスにおけるGABA A –受容体の選択的アンタゴニストの適用中にICニューロンのシングルユニット活動を記録するために前述の方法を組み合わせたプロトコルを提示します。まず、ピギーバック電極と次の、外科的および記録方法の製造を説明します。薬物放出の有効性を試験するために、我々は受容野と同様に前とgabazineのmicroiontophoretic排出中のICニューロンのSSAのレベルを比較しました。

Protocol

全ての実験手順は、の承認を得て、サラマンカ大学で行われ、サラマンカの動物管理委員会の大学、​​の基準だけでなく、欧州連合（指令63分の2010 / EU）の規格に準拠した方法を使用していました神経科学研究における動物の使用。 1.タングステン電極注：タングステン電極の製造はメリルとエインズワース27とエインズワースら 28に記載された</…

Representative Results

私たちは、ICの4よく分離されたニューロンのシングルユニット活動を記録しました。覚醒マウスにおける細胞外記録中に得られた代表的な信号対雑音比は、 図3Bに示されている。 図4Aは、前及びGABA Aの遮断がgabazineで-受容体の間に各ニューロンの周波数応答領域（FRA）を示します。応答の強さ（スパイク/刺激）と同様に、スペクトル…

Discussion

覚醒した動物における神経活性物質のmicroiontophoresisは、プローブと単一ニューロン40,41の活性に特定のシナプス入力の役割を分析するための強力な手法です。さらに重要なのは、この手順では、麻酔薬の潜在的な干渉なしに神経回路上の神経伝達物質および神経調節物質の影響の決意を可能にします。ここで、我々は目を覚ましたマウスのICでgabazineのアプリケーションはロバスト周?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MINECOによって資金を供給されたこのプロジェクトは、BFU201343608-PとPSI2013-49348-EXP、およびARPにMSMとMRCコア資金へのJCYLグラントSA343U14を付与します。 YAAはCONACyT（216106）と9月の交わりを開催しました。

Materials

Tungsten wire Harvard Apparatus LTD 33-0099 0.005 inches x 3 inches
Borosilicate glass capillary  Harvard Apparatus LTD 30-0053 Borosilicate standard wall without filament, 1.5 mm OD, 0.86 mm ID, 100 mm long
Multibarrel glass capillaries  World Precision Instruments 5B120F-4  5-barrel capillary, 4 inches long, 1.2 mm OD, with filament
Diaplus DiaDent 2001-2101 Light-curing adhesive, used to attach the tungsten electrode to the glas multibarrel pipette
G-Bond GC Corporation 2277 Light-curing adhesive, used to attach the headpost to the animal's skull
Charisma Heraeus Kulzer 66000087 Light-curing composite, used to reinforce the bond of the headpost with the skull
Araldit Cristal Ceys 2-component expoxy, used to further secure the attachment of the tungsten electrode to the glass multibarrel pipette
Heating blanket Cibertec RTC1
Stereotactic frame Narishige SR-6N Modified for mice
Microiontophoretic device Harvard Apparatus LTD Neurophore BH-2 Including IP-2 iontophoresis pumps (one for each drug delivery channel) and a balance module
Multibarrel glass pipette puller Narishige Model PE-21
LED lamp Technoflux CV-215 5 W, 430-485 nm
MicroFil World Precision Instruments MF34G-5 Flexible plastic needle, 34 AWG
Imalgene Merial Ketamine, 100 mg/mL
Rompun Bayer Xylazine, 20 mg/mL
Gabazine / SR-95531 Sigma S106 Prepare ~ 1000µl of 20 mM gabazine in distilled water and adjust the pH to 4
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Riferimenti

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Ayala, Y. A., Pérez-González, D., Duque, D., Palmer, A. R., Malmierca, M. S. Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice. J. Vis. Exp. (111), e53914, doi:10.3791/53914 (2016).
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