بمساعدة الليزر تسليخ مجهري (لام) كأداة للالترانسكربتي التنميط من أنواع الخلايا الفردية
Summary
Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.
Abstract
The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.
Introduction
في دراسات النسخي به على مستوى الأنسجة، وغالبا ما يتم حجب ترنسكربيتوم من أنواع الخلايا المتخصصة جدا ولكن نادرة من الخلايا المحيطة بها أكثر وفرة. مثال لمثل هذه أنواع الخلايا المتخصصة جدا هي خلايا النسب التناسلي للأنثى (الخط الجرثومي) في النباتات. يتم تحديد سلالة الجرثومية الإناث داخل البويضات النامية، والسلائف من البذور داخل وزيم من 1،2 زهرة. الخلية أبواغ الضخمة الأم (MMC) هي الخلية الأولى من سلالة الجرثومية الإناث. فإنه يخضع لالانقسام الاختزالي لتشكيل الرباعيات انخفاض megaspores. عادة، واحد فقط من هذه megaspores على قيد الحياة ويقسم ميتوتيكلي دون الانقسام السيتوبلازمي، أي في مخلى. يتم اتباع هذه mitoses من cellularization لتشكيل الأمشاج ناضجة، الذي يتكون عادة من أربعة أنواع الخلايا: ثلاثة antipodals، خليتين synergid، والبيض، والخلية المركزية. الخلايا البيض والمركزية هي الأمشاج الأنثوية التي تحصل المخصبة من قبل اثنين من الخلايا المنوية خلال ضوالإخصاب بلي لتؤدي إلى الجنين والسويداء من 1،2 البذور النامية. في النظام النموذجي نبات الأرابيدوبسيس thaliana الجنسي، فقط ~ 50 البذور تنمو في زهرة حين أن حوالي 50 – 80 وضع البذور في زهرة في جنس ترتبط ارتباطا وثيقا Boechera. وهكذا، فإن سلالة الجرثومية الإناث يتكون من عدد قليل من أنواع الخلايا المتخصصة للغاية، مما يجعلها نموذجا ممتازا لدراسة العمليات التنموية، مثل مواصفات الخلايا والتمايز.
وعلاوة على ذلك، يمكن رؤية واضحة حول العمليات التنظيمية الجينات التي تنظم تكاثر النبات تكون ذات قيمة تطبيقية. في النباتات، ويمكن أن يحدث كل من التكاثر الجنسي واللاجنسي من خلال البذور (تكاثر لاتعرسي). في حين التكاثر الجنسي يولد التنوع الجيني في عدد السكان، تكاثر لاتعرسي يؤدي إلى تشكيل ذرية نسيلي مطابق وراثيا للنبات الأم. لذلك، تكاثر لاتعرسي لديها امكانات كبيرة للتطبيقات في مجال الإنتاج الزراعي والبذور، وكذلك يمكن المورثات الأمهات حتى المعقدةالإبقاء دون تغيير على مدى أجيال عدة 3،4،5. بسبب تكاثر لاتعرسي لا تحدث طبيعيا في أي نوع من المحاصيل الرئيسية، هندسة تكاثر لاتعرسي في المحاصيل ذات 3،4،5 اهتمام كبير. ومع ذلك، فإن هذا الهدف على المدى الطويل هو من الصعب تحقيق لأنه لم يفهم الأساس الجيني والجزيئي الكامن وراء تكاثر لاتعرسي بتفصيل كاف 6.
للحصول على نظرة ثاقبة أساس النسخي تحكم الاستنساخ apomictic، خلية نوع محدد النسخي التنميط باستخدام تسليخ مجهري بمساعدة الليزر (لام) وتسلسل الجيل القادم (خ ع) يمثل طريقة فعالة جدا 7،8. وأول مرة يتم إنشاء LAM للبحوث الطبية الحيوية الحيوانية و. في السنوات القليلة الماضية، كما تم تطبيق لام لبيولوجيا النبات 6،9،10. وعلى النقيض من أساليب أخرى تسمح التنميط من أنواع الخلايا والأنسجة الفردية، لا لام لا تتطلب جيل من خطوط علامة 6،9،10. لذلك، يمكن أن يكون التطبيقكذب على أي خلية أو نسيج نوع دون معرفة الجزيئية السابقة. ميزة أخرى للام هو أنه يمكن تطبيقها على أي نوع من الخلايا طالما يمكن التعرف على الخلية في أقسام الجافة على أساس الموقف و / أو السمات الهيكلية. لام لديه ميزة إضافية أن تستخدم الأنسجة الثابتة، والذي يمنع التغييرات في الشخصية النسخي أثناء معالجة.
الأنسجة من الاهتمام، على سبيل المثال، الأنسجة النباتية، ثابتة في تثبيتي غير يشابك قبل التضمين في شمع البارافين. التضمين في شمع البارافين ويمكن أن يتم يدويا، بعد البروتوكولات المعمول 9،11. ومع ذلك، فإن استخدام معالج النسيج الآلي للجفاف وتسلل مع الشمع النتائج بشكل عام في أعلى استنساخ من حيث الحفاظ على الحمض النووي الريبي الجودة والتشكل الأنسجة. كما تم استخدام استراتيجية بديلة من تضمين الأنسجة في الراتنج بنجاح لتحليل نوع معين من الخلايا LAM 8. ومع ذلك، فإن استخدام وسيلة أبواATED معالج الأنسجة مبنية الشمع هو وقتا طويلا جدا كفاءة، كما العديد من العينات يمكن معالجتها في تتطلب مرة واحدة كحد أدنى من التدريب العملي في الوقت المحدد. في حين تحدث عادة أي خسائر كبيرة في الحمض النووي الريبي الجودة أثناء التثبيت والتضمين، وإعداد الشرائح الرقيقة مع مشراح، وعلى وجه الخصوص، وتصاعد على frameslides تستخدم للام يبقى خطوة حاسمة للحفاظ على نوعية الحمض النووي الريبي. وقد سبق الإشارة إلى ذلك، وصفت استخدام نظام نقل الشريط أن يؤدي إلى تحسين نوعية الحمض النووي الريبي في هذه الخطوة 12. ومع ذلك، وهذا يضيف خطوة إضافية تستغرق وقتا طويلا أثناء إعداد الشرائح ويتطلب أيضا معدات خاصة. بروتوكول الأمثل هو موضح أدناه ينتج بتكاثر الحمض النووي الريبي التي هي ذات نوعية كافية لتحديد ملامح النسخي مع GeneCHIPs والجيل القادم التسلسل (خ ع) النهج 7،11،13،14. وبالإضافة إلى ذلك، مع المجهر تسليخ مجهري الليزر المستخدمة، ونقاء عالية من أنواع الخلايا المعزولة هو هزيمةأنتجت inely 7،11،13،14.
جنس Boechera هو نظام نموذجا ممتازا لدراسة الخطوات الرئيسية لاستنساخ apomictic. في Boechera، وقد تم تحديد مجموعة متنوعة من مختلف انضمام الجنسية وapomictic، ويمكن استخدامها لتحليلات مقارنة 15،16،17. في مقارنة بين ترنسكربيتوم خلية نوع محدد من الخلايا من سلالة الجرثومية الإناث من نبات الأرابيدوبسيس الجنسي وapomictic Boechera، حددنا الجينات والممرات التي يتم التعبير عنها بشكل مختلف، وبالتالي تحديد جوانب جديدة من العمليات التنظيمية التي تحكم تكاثر لاتعرسي 7. وبالإضافة إلى ذلك، التحقق منها هذه الدراسة مدى ملاءمة لام لنوع محدد خلية النسخي تحليل أنواع الخلايا الصغيرة ونادرة. لقد استخدمت بالفعل هذا البروتوكول لتحليل أنواع مختلفة من الخلايا في مجموعة متنوعة من أنواع النباتات، ولكن species- وقد تكون هناك حاجة تعديلات الأنسجة محددة للبروتوكول في بعض الحالات.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول غير مناسبة للخلية مختلفة وأنواع الأنسجة
لام جنبا إلى جنب مع Transcriptome على التحليلات التي المجهرية أو RNA تسلسل هو أداة قيمة لاكتساب نظرة ثاقبة لأنماط معينة من النشاط الجيني تنظيم العمليات التنموية أو الفسيولوجية <…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Timothy F. Sharbel (IPK Gatersleben) for providing Boechera divaricarpa seeds and Sharon Kessler (University of Oklahoma) for critical reading and proofreading. Work on cell type-specific transcriptome analyses to study gametophyte development and apomixis in UG´s laboratory is supported by the University of Zürich, by a fellowship of the “Deutsche Forschungsgemeinschaft” and the Marie Curie project IDEAGENA to AS, by grants from the “Staatssekretariat für Bildung und Forschung” in the framework of COST action FA0903 (to UG and AS) and the Swiss National Foundation (to UG).
Materials
| Ethanol | VWR | 1,009,861,000 | absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP |
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939AA | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Ambion Nuclease free water | life technologies | AM9932 | |
| ASP200 S | Leica | 14048043624 | tissue processor |
| black cardboard | can be purchased in special paper shops | ||
| DNA- and RNAse-free Frame Slides | Micro Dissect GmbH | 1,4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| ethanol lamp | |||
| exsiccator | Sigma-Aldrich | Z354074-1EA | Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment |
| filter tips 10 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 1000 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 20 µl | Axon Lab AG | AL60020 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 200 µl | Axon Lab AG | AL60200 | can be replaced by similar tips |
| forceps precision | VWE | 232-1221 | |
| glass slide holder | Huber & Co.AG | 10.0540.01 | Färbekästen nach Hellendahl |
| glass staining trough | Huber & Co.AG | 10.0570.01 | Färbekasten |
| Heated Paraffin Embedding Module Leica | Leica | Leica EG 1150 H | blocking station, similar devises are suitable |
| Heating and Drying Table | Medax | 15501 | other models and/or suppliers are suitable |
| ice bucket | VWR ice bucket with lid | 10146-184 | similar buckets equally suitable |
| light table | UVP An Analytical Jena Company | TW-26 | white light transluminator |
| microscope slide | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| microtome blade | Thermo Scientific | FEAHS35 | S35 microtome blade disposable |
| MMI Cell Cut Plus Instrument | MMI (Molecular Machines and Industries) | ||
| Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2ml | life technologies | AM12475 | |
| Paraplast X-TRA | Roth | X882.2 | for histology |
| PicoPure RNA Isolation Kit | life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| plastic balancing trays | Semadeni AG | 2513 | |
| plastic box | Semadeni AG | 2971 | Plastikdose PS |
| plastic lid for heating plate | homemade | ||
| preparation needle | VWR | 631-7159 | |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse free microfuge tubes | life technologies | AM12400 | |
| RNAse ZAP Decontamination Solution | life technologies | AM9780 | |
| Semi-automated Rotary Microtome | Leica | RM2245 | similar devises are equally suitable |
| Tissue Loc Histo Screen Cassettes | Thermo Scientific | C-1000_AQ | similar cassettes of other suppliers are suitable |
| Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl | MMI (Molecular Machines and Industries) | 50204 | |
| Xylol (Isomere) ROTIPURAN | VWR | 4436.2 | min. 99 %, p.a.,ACS, ISO SP |
| process embedding cassettes | Leica | 14039440000 | Leica Jet Cassette I without lid |
| Universal Oven | Memmert | UF55 | other models and/or suppliers are suitable |
Riferimenti
- Maheshwari, P. . An Introduction to the Embryology of Angiosperms. , (1950).
- Willemse, M. T. M., Van Went, J. L., Johri, B. M. The female gametophyte. Embryology of Angiosperms. , 159-196 (1984).
- Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization. Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).
- Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. Apomixis – the asexual revolution. Science. 274, 1322-1323 (1996).
- Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. A bright future for apomixis. Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).
- Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction. Development. 142, 229-241 (2015).
- Schmidt, A., et al. Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation. PLOS GENET. 10, e1004476 (2014).
- Okada, T., et al. Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis. Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).
- Wuest, S. E., Grossniklaus, U. Laser-assisted microdissection applied to floral tissues. Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).
- Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development. Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).
- Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20, 1-7 (2010).
- Cai, S., Lashbrook, C. C. Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling. Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).
- Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development. PLOS BIOL. 9, e1001155 (2011).
- Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLOS ONE. 7, e29685 (2012).
- Mau, M., et al. Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors. Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).
- Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages. Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).
- Corral, J. M., et al. A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species. Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).
- Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments. Plant J. 55, 746-775 (2008).
- Schmid, M. W. . Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana. , 40-104 (2015).
