Laser-assisteret mikrodissektion (LAM) som værktøj for transskriptionsprofilering af enkelte celle Typer
Summary
Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.
Abstract
The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.
Introduction
I transkriptionelle undersøgelser udført på vævet niveau, er transcriptomes af højt specialiserede, men sjældne celletyper ofte maskeret af de mere rigelige omkringliggende celler. Et eksempel på sådanne højt specialiserede celletyper er cellerne i den kvindelige reproduktive linjen (germline) i planter. Den kvindelige kønscellelinie er specificeret i udviklingslandene frøanlæg, forløberne for frø inde i frugtanlæg af blomsten 1,2. Den megaspore mor celle (MMC) er den første celle i den kvindelige kimcellelinje. Det gennemgår meiose at danne en tetrade af reducerede megaspores. Typisk kun én af disse megaspores overlever og opdeler mitotisk uden cytokinese, dvs i et syncytium. Disse mitose efterfølges af cellularization til dannelse af den modne gametofyt, som typisk består af fire celletyper: tre antipodals, to synergid celler, ægget, og den centrale celle. De æg og centrale celler er de kvindelige kønsceller der bliver befrugtede af to sædceller under douligt befrugtning at give anledning til embryo og endosperm af frøet udviklende 1,2. I det seksuelle modelsystem Arabidopsis thaliana, kun ~ 50 frø udvikle per blomst mens omkring 50-80 frø udvikle per blomst i den nært beslægtede slægten Boechera. Således er den kvindelige kimcellelinje består af kun et par højt specialiserede celletyper, hvilket gør det til et fremragende model til at studere udviklingsmæssige processer, såsom celle specifikation og differentiering.
Desuden kan indsigt i gen regulatoriske processer, der styrer plante reproduktion have anvendt værdi. I planter, kan både kønnet og ukønnet formering gennem frø (apomixis) forekomme. Mens seksuel reproduktion genererer genetisk diversitet i en population, apomixis fører til dannelsen af klonal afkom, der er genetisk identisk med moderplanten. Derfor apomixis har et stort potentiale til applikationer i landbrug og frø, som selv komplekse moderlige genotyper kanopretholdes uændret over flere generationer 3,4,5. Fordi apomixis ikke naturligt forekommer i nogen større afgrødearter, engineering af apomixis i afgrøder er af stor interesse 3,4,5. Men dette langsigtede mål er vanskeligt at opnå, fordi den underliggende genetiske og molekylære grundlag for apomixis ikke forstås tilstrækkeligt detaljeret 6.
For at få indblik i den transkriptionelle grundlag for apomiktiske reproduktion, celletype-specifikke transkriptionel profilering ved hjælp af laser-assisteret mikrodissektion (LAM) og næste generation sekventering (NGS) repræsenterer en meget kraftig tilgang 7,8. LAM er først blevet etableret for dyr og biomedicinsk forskning. I de sidste par år LAM også er blevet anvendt på plantebiologi 6,9,10. I modsætning til andre fremgangsmåder, der tillader profilering af de enkelte celle- og vævstyper, er LAM ikke nødvendigt at fremskaffe markeringslinierne 6,9,10. Derfor kan det være appløj til en celle eller vævstype uden forudgående molekylær viden. En anden fordel ved LAM er, at det kan anvendes på enhver celletype, så længe cellen kan genkendes i tørre sektioner baseret på positions- og / eller strukturelle funktioner. LAM har den yderligere fordel, at fikserede væv anvendes, hvilket forhindrer ændringer af transskriptionsprofilen under behandlingen.
Vævet af interesse, fx floral væv, er fastgjort i en ikke-tværbindende fiksativ før indlejring i paraffinvoks. Indlejring i paraffinvoks kan gøres manuelt, ifølge etablerede protokoller 9,11. Imidlertid er anvendelsen af en automatiseret vævsprocessor for dehydrering og infiltration med voks resulterer generelt i højere reproducerbarhed med hensyn til bevarelse af RNA kvalitet og vævsmorfologi. Den alternative strategi for at integrere væv i harpiks har også været brugt med held til celle typespecifikke analyser af LAM 8. Imidlertid er anvendelsen af en automated væv processor til indlejring i voks er meget tid effektivt, da mange prøver kan behandles på én gang kræver et minimum af hands-on tid. Mens opstår typisk ingen signifikant tab af RNA kvalitet under fiksering og forankring, udarbejdelse af tynde sektioner med mikrotomen og især, at montering på frameslides anvendes til LAM stadig et afgørende skridt til konservering af RNA kvalitet. Dette er tidligere blevet bemærket, og anvendelsen af en overførsel tape system er blevet beskrevet at resultere i bedre RNA kvalitet på dette trin 12. Men dette tilføjer en ekstra tidskrævende trin under forberedelsen af dias og kræver også særligt udstyr. Den optimerede protokol beskrevet nedenfor reproducerbart producerer RNA, som er af tilstrækkelig kvalitet til transkriptionel profilering med GeneCHIPs og Next Generation Sequencing (NGS) nærmer 7,11,13,14. Desuden med laseren mikrodissektion mikroskop anvendes, en høj renhed af de isolerede celletyper er flugtinely produceret 7,11,13,14.
Slægten Boechera er en fremragende model til undersøgelse af de vigtigste trin i apomiktiske reproduktion. I Boechera, har en række forskellige seksuelle og apomiktiske tiltrædelser blevet identificeret og kan bruges til sammenlignende analyser 15,16,17. I en sammenligning af celletype-specifikke transcriptomes af celler fra den kvindelige kimcellelinje fra seksuel Arabidopsis og apomiktiske Boechera, vi identificeret gener og veje, der er differentielt udtrykte, hvorved der identificeres nye sider af de regulatoriske processer vedrørende apomixis 7. Derudover denne undersøgelse bekræftet egnetheden af LAM for celletype-specifik transkriptionel analyser af små og sjældne celletyper. Vi har allerede brugt denne protokol til analyse af forskellige celletyper i en række forskellige plantearter, men arts- og kan være påkrævet vævsspecifikke ændringer af protokollen i visse tilfælde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen er egnet til forskellige celler og væv Typer
LAM kombineret med transkriptom analyser af microarrays eller RNA-Seq er et værdifuldt værktøj til at få indsigt i de specifikke mønstre af genaktivitet regulerer udviklingsmæssige eller fysiologiske processer 7-11,13,14. Men egnethed denne metode for en given celletype er kritisk afhængig af strukturelle spørgsmål. Cellen skal være klart synlige og utvetydigt kunne identificeres i de tørre sekti…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Timothy F. Sharbel (IPK Gatersleben) for providing Boechera divaricarpa seeds and Sharon Kessler (University of Oklahoma) for critical reading and proofreading. Work on cell type-specific transcriptome analyses to study gametophyte development and apomixis in UG´s laboratory is supported by the University of Zürich, by a fellowship of the “Deutsche Forschungsgemeinschaft” and the Marie Curie project IDEAGENA to AS, by grants from the “Staatssekretariat für Bildung und Forschung” in the framework of COST action FA0903 (to UG and AS) and the Swiss National Foundation (to UG).
Materials
| Ethanol | VWR | 1,009,861,000 | absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP |
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939AA | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Ambion Nuclease free water | life technologies | AM9932 | |
| ASP200 S | Leica | 14048043624 | tissue processor |
| black cardboard | can be purchased in special paper shops | ||
| DNA- and RNAse-free Frame Slides | Micro Dissect GmbH | 1,4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| ethanol lamp | |||
| exsiccator | Sigma-Aldrich | Z354074-1EA | Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment |
| filter tips 10 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 1000 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 20 µl | Axon Lab AG | AL60020 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 200 µl | Axon Lab AG | AL60200 | can be replaced by similar tips |
| forceps precision | VWE | 232-1221 | |
| glass slide holder | Huber & Co.AG | 10.0540.01 | Färbekästen nach Hellendahl |
| glass staining trough | Huber & Co.AG | 10.0570.01 | Färbekasten |
| Heated Paraffin Embedding Module Leica | Leica | Leica EG 1150 H | blocking station, similar devises are suitable |
| Heating and Drying Table | Medax | 15501 | other models and/or suppliers are suitable |
| ice bucket | VWR ice bucket with lid | 10146-184 | similar buckets equally suitable |
| light table | UVP An Analytical Jena Company | TW-26 | white light transluminator |
| microscope slide | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| microtome blade | Thermo Scientific | FEAHS35 | S35 microtome blade disposable |
| MMI Cell Cut Plus Instrument | MMI (Molecular Machines and Industries) | ||
| Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2ml | life technologies | AM12475 | |
| Paraplast X-TRA | Roth | X882.2 | for histology |
| PicoPure RNA Isolation Kit | life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| plastic balancing trays | Semadeni AG | 2513 | |
| plastic box | Semadeni AG | 2971 | Plastikdose PS |
| plastic lid for heating plate | homemade | ||
| preparation needle | VWR | 631-7159 | |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse free microfuge tubes | life technologies | AM12400 | |
| RNAse ZAP Decontamination Solution | life technologies | AM9780 | |
| Semi-automated Rotary Microtome | Leica | RM2245 | similar devises are equally suitable |
| Tissue Loc Histo Screen Cassettes | Thermo Scientific | C-1000_AQ | similar cassettes of other suppliers are suitable |
| Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl | MMI (Molecular Machines and Industries) | 50204 | |
| Xylol (Isomere) ROTIPURAN | VWR | 4436.2 | min. 99 %, p.a.,ACS, ISO SP |
| process embedding cassettes | Leica | 14039440000 | Leica Jet Cassette I without lid |
| Universal Oven | Memmert | UF55 | other models and/or suppliers are suitable |
Riferimenti
- Maheshwari, P. . An Introduction to the Embryology of Angiosperms. , (1950).
- Willemse, M. T. M., Van Went, J. L., Johri, B. M. The female gametophyte. Embryology of Angiosperms. , 159-196 (1984).
- Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization. Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).
- Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. Apomixis – the asexual revolution. Science. 274, 1322-1323 (1996).
- Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. A bright future for apomixis. Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).
- Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction. Development. 142, 229-241 (2015).
- Schmidt, A., et al. Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation. PLOS GENET. 10, e1004476 (2014).
- Okada, T., et al. Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis. Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).
- Wuest, S. E., Grossniklaus, U. Laser-assisted microdissection applied to floral tissues. Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).
- Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development. Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).
- Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20, 1-7 (2010).
- Cai, S., Lashbrook, C. C. Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling. Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).
- Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development. PLOS BIOL. 9, e1001155 (2011).
- Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLOS ONE. 7, e29685 (2012).
- Mau, M., et al. Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors. Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).
- Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages. Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).
- Corral, J. M., et al. A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species. Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).
- Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments. Plant J. 55, 746-775 (2008).
- Schmid, M. W. . Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana. , 40-104 (2015).
