Laser-assisted Microdissection (LAM) als een tool voor Transcriptionele Profiling van individuele cel Types
Summary
Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.
Abstract
The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.
Introduction
Transcriptionele studies uitgevoerd op het weefsel niveau worden de transcriptomes zeer gespecialiseerde maar zeldzame celtypen vaak gemaskeerd door overvloediger omringende cellen. Een voorbeeld van zo'n gespecialiseerde celtypes zijn de cellen van de vrouwelijke reproductieve lijn (kiembaan) in planten. Het vrouwtje kiemlijn wordt opgegeven binnen de ontwikkeling van eitjes, de voorlopers van zaden binnen de gynoecium van de bloem 1,2. De megaspore moedercel (MMC) is de eerste cel van de vrouwelijke kiemlijn. Ondergaat meiosis een viertal verminderde megasporen vormen. Gewoonlijk slechts één van deze megaspores overleeft en scheidt mitotisch zonder cytokinese, dat wil zeggen in een syncytium. Deze mitosen worden gevolgd door cellularization aan de rijpe gametophyte, die meestal bestaat uit vier soorten cellen vormen: drie antipodals, twee synergid cellen, het ei, en de centrale cel. Het ei en de centrale cellen zijn de vrouwelijke gameten die krijgen bevrucht door twee zaadcellen tijdens double bevruchting aanleiding geven tot het embryo en endosperm van de zich ontwikkelende zaad 1,2 geven. In de seksuele modelsysteem Arabidopsis thaliana, alleen ~ 50 zaden ontwikkelen per bloem terwijl ongeveer 50-80 zaden ontwikkelen per bloem in het nauw verwante geslacht Boechera. Dus de vrouwelijke kiemlijn bestaat uit slechts enkele zeer gespecialiseerde celtypen, waardoor het een uitstekend model voor ontwikkelingsprocessen, zoals celspecificatie en differentiatie te bestuderen.
Bovendien kan inzicht in het gen regulerende processen die reproductie planten van de toegepaste waarde. In planten, kan zowel geslachtelijke en ongeslachtelijke voortplanting door middel van zaden (apomixis) optreden. Terwijl geslachtelijke voortplanting genereert genetische diversiteit in een populatie, apomixis leidt tot de vorming van klonale nakomelingen die genetisch identiek aan de moederplant. Daarom apomixis heeft een groot potentieel voor toepassingen in de landbouw en de productie van zaaizaad, want zelfs complexe moeder genotypen kanover meerdere generaties 3,4,5 ongewijzigd worden gehandhaafd. Omdat apomixis niet van nature voorkomt in alle belangrijke soorten gewassen, de engineering van apomixis in gewassen is van groot belang 3,4,5. Echter, deze lange-termijn doel is moeilijk te bereiken, omdat de onderliggende genetische en moleculaire basis van apomixis niet begrepen wordt in voldoende detail 6.
Om inzicht in de transcriptie basis betreffende apomictische reproductie, celtype-specifieke transcriptie profiling met behulp van laser-assisted microdissectie (LAM) en next generation sequencing (NGS) te krijgen is een zeer krachtige benadering 7,8. LAM eerst is vastgesteld voor dieren en biomedisch onderzoek. In de afgelopen jaren LAM is ook toegepast om te planten biologie 6,9,10. In tegenstelling tot andere systemen die een beoordeling van afzonderlijke cellen en weefseltypes, is LAM niet het genereren van markeerlijnen 6,9,10 vereisen. Daarom kan het appgelogen om een cel of weefsel type, zonder voorafgaande moleculaire kennis. Een ander voordeel van LAM is dat het kan worden toegepast op elk celtype mits de cel droge delen te herkennen op basis van de positie en / of structurele kenmerken. LAM heeft als bijkomend voordeel dat gefixeerde weefsels worden toegepast, waarbij afwijkingen van de transcriptionele profiel voorkomt tijdens de verwerking.
Het weefsel van belang, bijvoorbeeld bloemen weefsel wordt gefixeerd in een niet-verknopende fixatief voorafgaand aan inbedding in paraffine. Inbedding in paraffine kan handmatig worden gedaan, na vastgestelde protocollen 9,11. Het gebruik van een geautomatiseerde weefselprocessor voor dehydratatie en infiltratie van de was resulteert in het algemeen in hogere reproduceerbaarheid in termen van het behoud van kwaliteit en RNA weefselmorfologie. De alternatieve strategie voor het inbedden van weefsels in hars is ook met succes toegepast voor celtype-specifieke analyses van LAM 8. Het gebruik van een automated weefselprocessor voor het inbedden in was zeer tijdbesparend, zoveel monsters tegelijkertijd de vereiste minimale hands-tijdig kan verwerken. Hoewel meestal geen significant verlies van kwaliteit RNA optreedt tijdens fixatie en inbedding, de bereiding van dunne secties met de microtoom en in het bijzonder de montage op de frameslides voor LAM blijft een kritische stap voor het behoud van RNA kwaliteit. Dit werd eerder opgemerkt en het gebruik van een tape transfersysteem is beschreven leiden tot een betere kwaliteit RNA bij deze stap 12. Echter, dit geeft een additionele tijdrovende stap tijdens de bereiding van de glijbanen en vereist ook speciale apparatuur. De geoptimaliseerde protocol hieronder beschreven produceert reproduceerbaar RNA dat is van voldoende kwaliteit voor de transcriptie profilering met GeneChips en Next Generation Sequencing (NGS) benaderingen 7,11,13,14. Bovendien, met de laser microdissectie microscoop gebruikt, een hoge zuiverheid van de geïsoleerde celtypes is routinely geproduceerd 7,11,13,14.
Het geslacht Boechera is een uitstekend model voor het bestuderen van de belangrijkste stappen van apomictische reproductie. In Boechera, hebben verschillende seksuele en apomictische toetredingen geïdentificeerd en kunnen worden gebruikt voor vergelijkende analyses 15,16,17. In een vergelijking van celtype-specifieke transcriptomes van cellen van de vrouwelijke kiemlijn van seksuele Arabidopsis en apomictische Boechera, we geïdentificeerde genen en van de wegen die differentieel uitgedrukt, waardoor nieuwe aspecten van de regulerende processen te identificeren met betrekking tot apomixis 7. Daarnaast is deze studie bevestigde de geschiktheid van LAM voor celtype-specifieke transcriptionele analyses van kleine en zeldzame celtypen. We hebben stond met het protocol voor de analyse van diverse celtypen in verschillende plantensoorten, maar soort- en weefsel-specifieke modificaties aan het protocol in bepaalde gevallen nodig.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol is geschikt voor verschillende cel- en weefseltechnologie Types
LAM gecombineerd met transcriptoom analyse van microarrays of RNA-Seq is een waardevol instrument om inzicht te krijgen in de specifieke patronen van de activiteit van genen reguleren ontwikkelings- of fysiologische processen 7-11,13,14 krijgen. De geschiktheid van deze methode voor een bepaalde celtype kritisch afhankelijk structurele problemen. De cel moet duidelijk zichtbaar en ondubbe…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Timothy F. Sharbel (IPK Gatersleben) for providing Boechera divaricarpa seeds and Sharon Kessler (University of Oklahoma) for critical reading and proofreading. Work on cell type-specific transcriptome analyses to study gametophyte development and apomixis in UG´s laboratory is supported by the University of Zürich, by a fellowship of the “Deutsche Forschungsgemeinschaft” and the Marie Curie project IDEAGENA to AS, by grants from the “Staatssekretariat für Bildung und Forschung” in the framework of COST action FA0903 (to UG and AS) and the Swiss National Foundation (to UG).
Materials
| Ethanol | VWR | 1,009,861,000 | absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP |
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939AA | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Ambion Nuclease free water | life technologies | AM9932 | |
| ASP200 S | Leica | 14048043624 | tissue processor |
| black cardboard | can be purchased in special paper shops | ||
| DNA- and RNAse-free Frame Slides | Micro Dissect GmbH | 1,4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| ethanol lamp | |||
| exsiccator | Sigma-Aldrich | Z354074-1EA | Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment |
| filter tips 10 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 1000 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 20 µl | Axon Lab AG | AL60020 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 200 µl | Axon Lab AG | AL60200 | can be replaced by similar tips |
| forceps precision | VWE | 232-1221 | |
| glass slide holder | Huber & Co.AG | 10.0540.01 | Färbekästen nach Hellendahl |
| glass staining trough | Huber & Co.AG | 10.0570.01 | Färbekasten |
| Heated Paraffin Embedding Module Leica | Leica | Leica EG 1150 H | blocking station, similar devises are suitable |
| Heating and Drying Table | Medax | 15501 | other models and/or suppliers are suitable |
| ice bucket | VWR ice bucket with lid | 10146-184 | similar buckets equally suitable |
| light table | UVP An Analytical Jena Company | TW-26 | white light transluminator |
| microscope slide | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| microtome blade | Thermo Scientific | FEAHS35 | S35 microtome blade disposable |
| MMI Cell Cut Plus Instrument | MMI (Molecular Machines and Industries) | ||
| Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2ml | life technologies | AM12475 | |
| Paraplast X-TRA | Roth | X882.2 | for histology |
| PicoPure RNA Isolation Kit | life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| plastic balancing trays | Semadeni AG | 2513 | |
| plastic box | Semadeni AG | 2971 | Plastikdose PS |
| plastic lid for heating plate | homemade | ||
| preparation needle | VWR | 631-7159 | |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse free microfuge tubes | life technologies | AM12400 | |
| RNAse ZAP Decontamination Solution | life technologies | AM9780 | |
| Semi-automated Rotary Microtome | Leica | RM2245 | similar devises are equally suitable |
| Tissue Loc Histo Screen Cassettes | Thermo Scientific | C-1000_AQ | similar cassettes of other suppliers are suitable |
| Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl | MMI (Molecular Machines and Industries) | 50204 | |
| Xylol (Isomere) ROTIPURAN | VWR | 4436.2 | min. 99 %, p.a.,ACS, ISO SP |
| process embedding cassettes | Leica | 14039440000 | Leica Jet Cassette I without lid |
| Universal Oven | Memmert | UF55 | other models and/or suppliers are suitable |
Riferimenti
- Maheshwari, P. . An Introduction to the Embryology of Angiosperms. , (1950).
- Willemse, M. T. M., Van Went, J. L., Johri, B. M. The female gametophyte. Embryology of Angiosperms. , 159-196 (1984).
- Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization. Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).
- Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. Apomixis – the asexual revolution. Science. 274, 1322-1323 (1996).
- Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. A bright future for apomixis. Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).
- Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction. Development. 142, 229-241 (2015).
- Schmidt, A., et al. Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation. PLOS GENET. 10, e1004476 (2014).
- Okada, T., et al. Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis. Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).
- Wuest, S. E., Grossniklaus, U. Laser-assisted microdissection applied to floral tissues. Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).
- Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development. Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).
- Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20, 1-7 (2010).
- Cai, S., Lashbrook, C. C. Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling. Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).
- Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development. PLOS BIOL. 9, e1001155 (2011).
- Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLOS ONE. 7, e29685 (2012).
- Mau, M., et al. Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors. Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).
- Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages. Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).
- Corral, J. M., et al. A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species. Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).
- Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments. Plant J. 55, 746-775 (2008).
- Schmid, M. W. . Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana. , 40-104 (2015).
