assistée par laser microdissection (LAM) comme outil de profilage transcriptionnel des types cellulaires individuels
Summary
Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.
Abstract
The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.
Introduction
Dans les études de transcription effectuées au niveau des tissus, les transcriptomes de types de cellules hautement spécialisées, mais rares sont souvent masqués par les cellules environnantes plus abondantes. Un exemple de ces types de cellules hautement spécialisées sont les cellules de la lignée de reproduction féminin (germinale) dans les plantes. La lignée germinale femelle est spécifié dans les ovules en développement, les précurseurs de graines à l' intérieur du gynécée du 1,2 fleur. La cellule mégaspore mère (MMC) est la première cellule de la lignée germinale femelle. Il subit la méiose pour former une tétrade de mégaspores réduits. En règle générale, une seule de ces mégaspores survit et se divise en mitose sans cytokinèse, soit dans un syncytium. Ces mitoses sont suivis par cellularisation pour former le gamétophyte mature, qui se compose généralement de quatre types de cellules: trois antipodes, deux cellules synergide, l'œuf et la cellule centrale. Les cellules d'oeufs et centrales sont les gamètes femelles qui se fécondés par deux spermatozoïdes pendant doufertilisation ble pour donner naissance à l'embryon et de l' albumen du 1,2 de graines de développement. Dans le sexuel système modèle Arabidopsis thaliana, seulement ~ 50 graines se développent par fleur tandis qu'environ 50 – 80 graines se développent par fleur dans le genre étroitement apparenté Boechera. Ainsi, la lignée germinale femelle se compose de seulement quelques types de cellules hautement spécialisées, ce qui en fait un excellent modèle pour étudier les processus de développement, tels que la spécification et la différenciation cellulaire.
En outre, un aperçu des processus de régulation des gènes régissant la reproduction des plantes peuvent être de valeur appliquée. Chez les plantes, à la fois la reproduction sexuée et asexuée par graines (apomixie) peut se produire. Bien que la reproduction sexuelle génère la diversité génétique dans une population, apomixie conduit à la formation de la progéniture clonale qui est génétiquement identique à la plante mère. Par conséquent, l'apomixie a un grand potentiel pour des applications dans l'agriculture et la production de semences, comme les génotypes maternels même complexes peuventêtre maintenu inchangé pendant plusieurs générations 3,4,5. Parce que apomixie ne se produit pas naturellement dans toutes les principales espèces cultivées, l'ingénierie de l' apomixie dans les cultures est d' une grande 3,4,5 d'intérêt. Cependant, cet objectif à long terme est difficile à réaliser parce que la base génétique et moléculaire sous – jacente de l' apomixie on ne comprend pas suffisamment détaillée 6.
Pour obtenir un aperçu de la base de la transcription qui régissent la reproduction apomictique, une cellule de type spécifique de transcription profilage à l' aide microdissection assistée par laser (LAM) et le séquençage de prochaine génération (NGS) représente une approche très puissante 7,8. LAM a d'abord été mis en place pour les animaux et la recherche biomédicale. Au cours des dernières années LAM a également été appliquée à la biologie végétale 6,9,10. Contrairement à d' autres méthodes permettant de profilage de types de cellules et de tissus, LAM ne nécessite pas la génération des lignes de marquage 6,9,10. Par conséquent, il peut être applimenti à une cellule ou d'un tissu de type sans connaissance moléculaire préalable. Un autre avantage de LAM est qu'il peut être appliqué à tout type de cellule aussi longtemps que la cellule peut être reconnu dans les sections sèches en fonction de la position et / ou les caractéristiques structurelles. LAM présente l'avantage supplémentaire que les tissus fixes sont utilisés, ce qui empêche toute modification du profil de transcription lors du traitement.
Le tissu d'intérêt, par exemple, le tissu floral, est fixé dans un fixateur non réticulant avant l'enrobage dans la paraffine. Incorporation dans la cire de paraffine peut être fait manuellement, en suivant les protocoles établis 9,11. Cependant, l'utilisation d'un processeur de tissu automatisé pour la déshydratation et l'infiltration avec la cire se traduit généralement par une reproductibilité élevée en termes de conservation de la qualité de l'ARN et la morphologie du tissu. La stratégie alternative d'incorporation des tissus en résine a également été utilisé avec succès pour des analyses spécifiques de type cellulaire par LAM 8. Cependant, l'utilisation d'un automprocesseur de tissus ATED pour l'enrobage dans de la cire est très efficace du temps, car de nombreux échantillons peuvent être traités à la fois exigeant un minimum de temps sur les mains. Bien qu'elle soit généralement pas de perte significative de qualité de l'ARN a lieu lors de la fixation et l'intégration, la préparation de sections minces avec le microtome et, en particulier, leur montage sur les frameslides utilisés pour LAM restent une étape essentielle pour la préservation de la qualité de l'ARN. Cela a déjà été noté et l'utilisation d'un système de transfert de bande a été décrite pour aboutir à une meilleure qualité de l' ARN à cette étape 12. Toutefois, cela ajoute une étape de temps supplémentaire lors de la préparation des diapositives et nécessite également un équipement spécial. Le protocole optimisé décrit ci – dessous produit reproductible ARN qui est d' une qualité suffisante pour le profilage transcriptionnel avec GeneChips et Next Generation Sequencing (NGS) approches 7,11,13,14. En outre, avec le microscope à microdissection laser utilisé, avec une pureté élevée des types de cellules isolées est routinely produit 7,11,13,14.
Le genre Boechera est un excellent modèle pour étudier les principales étapes de la reproduction apomictique. Dans Boechera, une variété de différentes accessions sexuelles et apomictiques ont été identifiés et peut être utilisé pour des analyses comparatives 15,16,17. Dans une comparaison des transcriptomes type de cellules spécifiques de cellules de la lignée germinale femelle d'Arabidopsis sexuelle et apomictique Boechera, nous avons identifié les gènes et les voies qui sont exprimés différemment, identifiant ainsi les nouveaux aspects des processus réglementaires régissant apomixie 7. En outre, cette étude a vérifié l'aptitude des cellules LAM pour la transcription spécifique du type d'analyses de types de cellules petites et rares. Nous avons déjà utilisé ce protocole pour l'analyse des différents types de cellules dans une variété d'espèces végétales, mais l'espèce et des modifications spécifiques de tissus au protocole peut être nécessaire dans certains cas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole est adapté à différents types de cellules et de tissus
LAM combinée avec transcriptome analyse par microarrays ou ARN-Seq est un outil précieux pour mieux comprendre les modèles spécifiques de l' activité des gènes régulant les processus de développement ou physiologiques 7-11,13,14. Cependant, la pertinence de cette méthode pour tout type de cellule donné dépend de façon critique sur les questions structurelles. La…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Timothy F. Sharbel (IPK Gatersleben) for providing Boechera divaricarpa seeds and Sharon Kessler (University of Oklahoma) for critical reading and proofreading. Work on cell type-specific transcriptome analyses to study gametophyte development and apomixis in UG´s laboratory is supported by the University of Zürich, by a fellowship of the “Deutsche Forschungsgemeinschaft” and the Marie Curie project IDEAGENA to AS, by grants from the “Staatssekretariat für Bildung und Forschung” in the framework of COST action FA0903 (to UG and AS) and the Swiss National Foundation (to UG).
Materials
| Ethanol | VWR | 1,009,861,000 | absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP |
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939AA | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Ambion Nuclease free water | life technologies | AM9932 | |
| ASP200 S | Leica | 14048043624 | tissue processor |
| black cardboard | can be purchased in special paper shops | ||
| DNA- and RNAse-free Frame Slides | Micro Dissect GmbH | 1,4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| ethanol lamp | |||
| exsiccator | Sigma-Aldrich | Z354074-1EA | Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment |
| filter tips 10 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 1000 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 20 µl | Axon Lab AG | AL60020 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 200 µl | Axon Lab AG | AL60200 | can be replaced by similar tips |
| forceps precision | VWE | 232-1221 | |
| glass slide holder | Huber & Co.AG | 10.0540.01 | Färbekästen nach Hellendahl |
| glass staining trough | Huber & Co.AG | 10.0570.01 | Färbekasten |
| Heated Paraffin Embedding Module Leica | Leica | Leica EG 1150 H | blocking station, similar devises are suitable |
| Heating and Drying Table | Medax | 15501 | other models and/or suppliers are suitable |
| ice bucket | VWR ice bucket with lid | 10146-184 | similar buckets equally suitable |
| light table | UVP An Analytical Jena Company | TW-26 | white light transluminator |
| microscope slide | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| microtome blade | Thermo Scientific | FEAHS35 | S35 microtome blade disposable |
| MMI Cell Cut Plus Instrument | MMI (Molecular Machines and Industries) | ||
| Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2ml | life technologies | AM12475 | |
| Paraplast X-TRA | Roth | X882.2 | for histology |
| PicoPure RNA Isolation Kit | life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| plastic balancing trays | Semadeni AG | 2513 | |
| plastic box | Semadeni AG | 2971 | Plastikdose PS |
| plastic lid for heating plate | homemade | ||
| preparation needle | VWR | 631-7159 | |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse free microfuge tubes | life technologies | AM12400 | |
| RNAse ZAP Decontamination Solution | life technologies | AM9780 | |
| Semi-automated Rotary Microtome | Leica | RM2245 | similar devises are equally suitable |
| Tissue Loc Histo Screen Cassettes | Thermo Scientific | C-1000_AQ | similar cassettes of other suppliers are suitable |
| Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl | MMI (Molecular Machines and Industries) | 50204 | |
| Xylol (Isomere) ROTIPURAN | VWR | 4436.2 | min. 99 %, p.a.,ACS, ISO SP |
| process embedding cassettes | Leica | 14039440000 | Leica Jet Cassette I without lid |
| Universal Oven | Memmert | UF55 | other models and/or suppliers are suitable |
Riferimenti
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