लेजर की मदद से अलग-अलग प्रकार की कोशिकाओं के Transcriptional प्रोफाइलिंग के लिए एक उपकरण के रूप में Microdissection (एलएएम)
Summary
Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.
Abstract
The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.
Introduction
ऊतक स्तर पर किया ट्रांसक्रिप्शनल अध्ययन में, अति विशिष्ट लेकिन दुर्लभ प्रकार की कोशिकाओं के transcriptomes अक्सर अधिक प्रचुर मात्रा में कोशिकाओं के आसपास के मुखौटे हैं। इस तरह के अति विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के लिए एक उदाहरण पौधों में महिला प्रजनन वंश (germline) की कोशिकाओं रहे हैं। महिला germline फूल 1,2 के जायांग अंदर, विकासशील बीजाणु के भीतर निर्दिष्ट किया जाता है बीज के व्यापारियों। megaspore मां सेल (एमएमसी) महिला germline के पहले सेल है। यह कम megaspores की एक tetrad के लिए फार्म अर्धसूत्रीविभाजन आए। आमतौर पर, इन megaspores का केवल एक ही बचता है और cytokinesis बिना mitotically बिताते हैं, यानी, एक संकोश में। तीन antipodals, दो synergid कोशिकाओं, अंडे, और केंद्रीय सेल: ये mitoses परिपक्व gametophyte है, जो आम तौर पर चार प्रकार की कोशिकाओं के होते हैं के लिए फार्म cellularization द्वारा पीछा किया जाता है। अंडा और केंद्रीय कोशिकाओं मादा युग्मक कि दोगुनी दौरान दो शुक्राणु कोशिकाओं से निषेचित हो रहे हैंble निषेचन भ्रूण और विकासशील बीज 1,2 के एण्डोस्पर्म को जन्म देने के लिए। यौन मॉडल प्रणाली Arabidopsis thaliana में, केवल ~ 50 बीज फूल प्रति विकसित करते हुए लगभग 50 – 80 बीज निकट से संबंधित जीनस Boechera में फूल प्रति विकसित करना। इस प्रकार, महिला germline, केवल कुछ अति विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के होते हैं यह इस तरह के सेल विनिर्देश और भेदभाव के रूप में विकास की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल बना रही है।
इसके अलावा, जीन विनियामक संयंत्र प्रजनन शासी प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि एप्लाइड मूल्य का हो सकता है। पौधों में, बीज (apomixis) के माध्यम से दोनों यौन और अलैंगिक प्रजनन हो सकता है। जबकि यौन प्रजनन आबादी में आनुवंशिक विविधता उत्पन्न करता है, प्रतिरूप संतानों के गठन कि आनुवंशिक रूप से माँ संयंत्र के लिए समान है की ओर जाता है apomixis। इसलिए, apomixis, कृषि और बीज उत्पादन में अनुप्रयोगों के लिए काफी संभावना है के रूप में भी जटिल मातृ जीनोटाइप कर सकते हैंकई पीढ़ियों 3,4,5 खत्म अनछुए बनाए रखा जाना। क्योंकि apomixis स्वाभाविक रूप से किसी भी प्रमुख फसल प्रजातियों में नहीं होती है, फसलों में apomixis के इंजीनियरिंग बहुत रुचि 3,4,5 की है। बहरहाल, यह लंबी अवधि के लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, क्योंकि apomixis की अंतर्निहित आनुवंशिक और आणविक आधार पर्याप्त विस्तार 6 में समझ नहीं है मुश्किल है।
Apomictic प्रजनन, सेल प्रकार विशिष्ट transcriptional रूपरेखा के शासी लेजर की सहायता microdissection (एलएएम) और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) का उपयोग ट्रांसक्रिप्शनल आधार में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए एक बहुत शक्तिशाली दृष्टिकोण 7.8 प्रतिनिधित्व करता है। लैम पहले पशु और जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए स्थापित किया गया है। पिछले कुछ वर्षों में लैम भी प्लांट बायोलॉजी 6,9,10 के लिए लागू किया गया है। अन्य विधियों के अलग-अलग सेल और ऊतक प्रकार की रूपरेखा के लिए अनुमति देता है के विपरीत, लैम मार्कर लाइनों 6,9,10 की पीढ़ी की आवश्यकता नहीं है। इसलिए, यह एप्लिकेशन हो सकता हैप्रायर आणविक ज्ञान के बिना किसी भी सेल या ऊतक प्रकार के लिए झूठ बोला था। लैम का एक अन्य लाभ यह है कि यह किसी भी प्रकार की कोशिका के रूप में लंबे समय के लिए लागू किया जा सकता है के रूप में सेल की स्थिति और / या ढांचागत सुविधाओं के आधार पर सूखी वर्गों में पहचाना जा सकता है। लैम अतिरिक्त लाभ यह है कि तय ऊतकों उपयोग किया जाता है, जो प्रसंस्करण के दौरान ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफ़ाइल के परिवर्तन को रोकता है।
ब्याज, जैसे, पुष्प ऊतक के ऊतक, पैराफिन मोम में एम्बेड करने से पहले एक गैर crosslinking लगानेवाला में तय हो गई है। पैराफिन मोम में एम्बेड मैन्युअल रूप से किया जा सकता है, स्थापित प्रोटोकॉल 9,11 के बाद। हालांकि, मोम के साथ निर्जलीकरण और घुसपैठ के लिए एक स्वचालित ऊतक प्रोसेसर का इस्तेमाल आम तौर पर शाही सेना गुणवत्ता और ऊतक आकृति विज्ञान के संरक्षण के मामले में उच्च reproducibility में यह परिणाम है। राल में ऊतकों embedding के वैकल्पिक रणनीति भी सफलतापूर्वक लैम 8 से सेल प्रकार विशिष्ट विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, एक autom का उपयोगमोम में embedding के लिए पैदा ऊतक प्रोसेसर, बहुत समय कुशल है के रूप में कई नमूने एक बार समय पर हाथों की एक न्यूनतम आवश्यकता होती है पर कार्रवाई की जा सकती है। आम तौर पर शाही सेना गुणवत्ता का कोई महत्वपूर्ण नुकसान निर्धारण और एम्बेडिंग के दौरान होता है, वहीं microtome के साथ पतली वर्गों की तैयारी और विशेष रूप से, लैम के लिए इस्तेमाल किया frameslides पर बढ़ते शाही सेना गुणवत्ता के संरक्षण के लिए एक महत्वपूर्ण कदम बनी हुई है। यह पहले उल्लेख किया गया है और एक टेप हस्तांतरण प्रणाली के उपयोग के इस कदम के 12 में बेहतर शाही सेना गुणवत्ता में परिणाम के लिए वर्णित किया गया है। हालांकि, इस स्लाइड की तैयारी के दौरान एक अतिरिक्त समय लेने वाली कदम कहते हैं और भी विशेष उपकरणों की आवश्यकता है। अनुकूलित नीचे वर्णित प्रोटोकॉल reproducibly आरएनए GeneCHIPs और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) दृष्टिकोण 7,11,13,14 साथ transcriptional रूपरेखा के लिए पर्याप्त गुणवत्ता की है कि पैदा करता है। इसके अलावा, लेजर microdissection इस्तेमाल किया माइक्रोस्कोप के साथ, अलग-थलग सेल प्रकार की एक उच्च शुद्धता राउत हैinely 7,11,13,14 का उत्पादन किया।
जीनस Boechera apomictic प्रजनन का महत्वपूर्ण कदम के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली है। Boechera में, विभिन्न यौन और apomictic accessions की एक किस्म की पहचान की गई है और तुलनात्मक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता 15,16,17 विश्लेषण करती है। यौन Arabidopsis और apomictic Boechera से महिला germline से कोशिकाओं की कोशिका प्रकार विशिष्ट transcriptomes की तुलना में, हम जीन और रास्ते कि विभिन्न व्यक्त कर रहे हैं की पहचान की है, जिससे नियामक प्रक्रियाओं के नए पहलुओं की पहचान गवर्निंग apomixis 7। इसके अलावा, इस अध्ययन के लिए छोटे और दुर्लभ प्रकार की कोशिकाओं का विश्लेषण करती है सेल प्रकार विशिष्ट transcriptional के लिए लैम की उपयुक्तता सत्यापित। हम पहले से ही पौधों की प्रजातियों की एक किस्म में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है, लेकिन species- और प्रोटोकॉल के लिए ऊतक विशेष संशोधनों के कुछ मामलों में आवश्यक हो सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल अलग सेल और ऊतक प्रकार के लिए उपयुक्त है
Transcriptome के साथ संयुक्त लैम प्रोटीन या द्वारा विश्लेषण शाही सेना Seq एक महत्वपूर्ण उपकरण विकास या शारीरिक प्रक्रियाओं को विनियमित करने …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Timothy F. Sharbel (IPK Gatersleben) for providing Boechera divaricarpa seeds and Sharon Kessler (University of Oklahoma) for critical reading and proofreading. Work on cell type-specific transcriptome analyses to study gametophyte development and apomixis in UG´s laboratory is supported by the University of Zürich, by a fellowship of the “Deutsche Forschungsgemeinschaft” and the Marie Curie project IDEAGENA to AS, by grants from the “Staatssekretariat für Bildung und Forschung” in the framework of COST action FA0903 (to UG and AS) and the Swiss National Foundation (to UG).
Materials
| Ethanol | VWR | 1,009,861,000 | absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP |
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939AA | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Ambion Nuclease free water | life technologies | AM9932 | |
| ASP200 S | Leica | 14048043624 | tissue processor |
| black cardboard | can be purchased in special paper shops | ||
| DNA- and RNAse-free Frame Slides | Micro Dissect GmbH | 1,4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| ethanol lamp | |||
| exsiccator | Sigma-Aldrich | Z354074-1EA | Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment |
| filter tips 10 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 1000 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 20 µl | Axon Lab AG | AL60020 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 200 µl | Axon Lab AG | AL60200 | can be replaced by similar tips |
| forceps precision | VWE | 232-1221 | |
| glass slide holder | Huber & Co.AG | 10.0540.01 | Färbekästen nach Hellendahl |
| glass staining trough | Huber & Co.AG | 10.0570.01 | Färbekasten |
| Heated Paraffin Embedding Module Leica | Leica | Leica EG 1150 H | blocking station, similar devises are suitable |
| Heating and Drying Table | Medax | 15501 | other models and/or suppliers are suitable |
| ice bucket | VWR ice bucket with lid | 10146-184 | similar buckets equally suitable |
| light table | UVP An Analytical Jena Company | TW-26 | white light transluminator |
| microscope slide | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| microtome blade | Thermo Scientific | FEAHS35 | S35 microtome blade disposable |
| MMI Cell Cut Plus Instrument | MMI (Molecular Machines and Industries) | ||
| Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2ml | life technologies | AM12475 | |
| Paraplast X-TRA | Roth | X882.2 | for histology |
| PicoPure RNA Isolation Kit | life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| plastic balancing trays | Semadeni AG | 2513 | |
| plastic box | Semadeni AG | 2971 | Plastikdose PS |
| plastic lid for heating plate | homemade | ||
| preparation needle | VWR | 631-7159 | |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse free microfuge tubes | life technologies | AM12400 | |
| RNAse ZAP Decontamination Solution | life technologies | AM9780 | |
| Semi-automated Rotary Microtome | Leica | RM2245 | similar devises are equally suitable |
| Tissue Loc Histo Screen Cassettes | Thermo Scientific | C-1000_AQ | similar cassettes of other suppliers are suitable |
| Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl | MMI (Molecular Machines and Industries) | 50204 | |
| Xylol (Isomere) ROTIPURAN | VWR | 4436.2 | min. 99 %, p.a.,ACS, ISO SP |
| process embedding cassettes | Leica | 14039440000 | Leica Jet Cassette I without lid |
| Universal Oven | Memmert | UF55 | other models and/or suppliers are suitable |
Riferimenti
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