Un metodo per identificare e isolare Airway-innervano neuroni sensoriali nei topi
Summary
Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.
Abstract
nervi somatosensoriali trasdurre termica, meccanica, chimica, e stimoli nocivi causati da due agenti endogeni e ambientali. I corpi cellulari di questi neuroni afferenti si trovano all'interno dei gangli sensoriali. gangli sensoriale innervano un organo specifico o porzione del corpo. Per esempio, i gangli della radice dorsale (DRG) si trovano nella colonna vertebrale e estendere processi in tutto il corpo e degli arti. I gangli del trigemino si trovano nel cranio e innervano la faccia, e le vie respiratorie superiori. afferenze vagali dei gangli nodose si estendono per tutto l'intestino, cuore e polmoni. I neuroni nodose controllano una gamma diversificata di funzioni quali: frequenza respiratoria, irritazione delle vie respiratorie, tosse e riflessi. Così, per capire e manipolare la loro funzione, è fondamentale per identificare e isolare vie aeree specifiche sotto-popolazioni neuronali. Nel topo, le vie aeree sono esposti a un colorante tracciante fluorescente, Fast Blue, per il tracciamento retrograda di specifiche vie aeree nodose neuroneS. I gangli nodose sono dissociate e la fluorescenza delle cellule attivate (FAC) l'ordinamento viene utilizzato per raccogliere le cellule positive colorante. Successivamente, l'acido ribonucleico di alta qualità (RNA) viene estratto dalle cellule positive dye per la prossima generazione di sequenziamento. Utilizzando questo metodo vie aeree specifica espressione genica neuronale è determinata.
Introduction
nervi somatosensoriali trasdurre termica, meccanica, chimica, e stimoli nocivi causati da due agenti endogeni e ambientali. I corpi cellulari di questi nervi afferenti si trovano nei gangli sensoriali, come la radice dorsale, trigemino, o gangli nodoso. Ogni ganglion sensoriale innerva regioni specifiche del corpo e contiene cellule che innervano organi e tessuti separati all'interno di tale regione. Per esempio, i gangli delle radici dorsali (DRG) si trovano nella colonna vertebrale e estendere i processi in tutto il corpo e gli arti, mentre i gangli del trigemino si trova nel cranio, che contiene neuroni che innervano il viso, gli occhi, le meningi e vie aeree superiori 1, 2. Il gangli nodose del nervo vago è situata nel collo sotto il cranio e contiene corpi cellulari che si estendono fibre nervose in tutto il tratto gastrointestinale, cuore e basse vie aeree e dei polmoni 3. Nell'uomo il ganglio nodoso sta da solo, tuttavia, nel topo è fusacon il ganglio giugulare, che innerva anche i polmoni 4. Questo ganglio fuso viene spesso chiamata la giugulare / nodoso complesso, ganglio vagale, o semplicemente nodoso ganglio 5. Qui, viene indicato come il ganglio nodoso.
fibre afferenti del nodosi passano informazioni dai visceri al nucleo del tratto solitario (NTS) nel tronco cerebrale. Input sensoriale a questo ganglio unico controlla una gamma diversificata di funzioni, come la motilità intestinale 6, frequenza cardiaca 7, la respirazione 8,9, e le risposte respiratorie irritanti attivato 10,11. Con questa diversità di funzioni e organi innervati, è fondamentale per indirizzare e isolare sottopopolazioni organo-specifiche del ganglio nodoso al fine di studiare percorsi neuronali individuali. Tuttavia, date le dimensioni del nodose e il numero limitato di neuroni che contiene questo non è un compito banale. Ogni topo nodose ganglio contiene circa 5.000 neuroni 12oltre a una vasta popolazione di cellule di supporto satellite. Dei 5.000 neuroni nodose, solo 3-5% innervano le vie respiratorie. Pertanto, eventuali modifiche funzionali, morfologiche o molecolari all'interno dei neuroni delle vie aeree-innervano, grazie alla stimolazione delle vie respiratorie o patologie, andranno perduti nel ganglio nodoso densamente.
Per risolvere questo problema, è stato sviluppato un metodo per identificare e isolare i neuroni che innervano le vie respiratorie. Le vie aeree sono stati esposti a un colorante tracciante fluorescente per identificare le successive neuroni innervano nodoso. Fast Blue è stato preso dai neuroni e viaggia rapidamente alle loro corpi cellulari dove viene conservata per un massimo di otto settimane 13 – 15. Una volta identificato, un dolce, ma efficace, il protocollo di dissociazione è stato utilizzato per preservare l'etichettatura tintura e la vitalità delle cellule per cellulare attivato fluorescente (FAC) di smistamento. Cellule separate vengono utilizzati per estrarre l'acido ribonucleico di alta qualità (RNA) per determinare l'espressione genica o Fo altra analisi molecolare valle. Questo protocollo fornisce una tecnica utile e robusto per isolare i neuroni sensoriali che innervano un tessuto di interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un metodo per indirizzare i neuroni delle vie aeree, che innervano nei gangli nodoso del nervo vago. Una volta etichettato, i gangli vengono delicatamente dissociate per conservare in modo ottimale il numero di cellule e la vitalità. Questi neuroni sono poi FAC allineati direttamente nel tampone di lisi e RNA viene estratto. Il significato di questo protocollo è la possibilità di individuare, isolare e preservare la qualità di una specifica popolazione di cellule sensoriali. L'espressi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supportato da NIH concedere R01HL105635 a SEJ. Gli autori desiderano ringraziare Diego V. Bohórquez consulenza tecnica. Ringraziamo anche R. Ian Cumming per l'assistenza tecnica e l'esecuzione della citometria a flusso al Duke Vaccine umana Research Institute citometria a flusso Shared Resource Facility (Durham, NC). La citometria a flusso è stato eseguito nel Laboratorio biocontenimento regionale presso la Duke, che ha ricevuto il supporto parziale per la costruzione dal National Institutes of Health, National Institute of Allergy e Malattie infettive (UC6-AI058607).
Materials
| Fast Blue | Polysciences, Inc. | 17740-2 | stock 2 mg/ml in water |
| NeuroTrace 530/615 red Nissle stain | Life Technologies | N21482 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free | Gibco | 14190-144 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| glutamine (Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 (no vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS |
| digestion enzyme, Liberase DH Research Grade | Roche | 5401054001 | stock 2.5 mg/ml in water |
| particle solution (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
| Heating block | LabNet | ||
| 70 um cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| RNase free water | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
| RNase decontamination reagent, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
| 2-mercaptoethanol | VWR | EM-6010 | |
| RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| DNase kit, RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| DNase | Sigma | D5025-15KU | stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | stock 10 µg/ml in PBS |
| Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) | Agilent |
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