I neuroni sensoriali specifici per organo sono difficili da identificare. Il tracciamento Fast Blue viene utilizzato per identificare i neuroni nodosi che innervano le vie aeree per lo smistamento cellulare. I neuroni nodose ordinati vengono utilizzati per estrarre acido ribonucleico (RNA) di alta qualità per il sequenziamento. Utilizzando questo protocollo, viene determinata l'espressione genica dei neuroni specifici delle vie aeree.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Un metodo per identificare e isolare Airway-innervano neuroni sensoriali nei topi
In questo articolo
Sommario
Abstract
nervi somatosensoriali trasdurre termica, meccanica, chimica, e stimoli nocivi causati da due agenti endogeni e ambientali. I corpi cellulari di questi neuroni afferenti si trovano all'interno dei gangli sensoriali. gangli sensoriale innervano un organo specifico o porzione del corpo. Per esempio, i gangli della radice dorsale (DRG) si trovano nella colonna vertebrale e estendere processi in tutto il corpo e degli arti. I gangli del trigemino si trovano nel cranio e innervano la faccia, e le vie respiratorie superiori. afferenze vagali dei gangli nodose si estendono per tutto l'intestino, cuore e polmoni. I neuroni nodose controllano una gamma diversificata di funzioni quali: frequenza respiratoria, irritazione delle vie respiratorie, tosse e riflessi. Così, per capire e manipolare la loro funzione, è fondamentale per identificare e isolare vie aeree specifiche sotto-popolazioni neuronali. Nel topo, le vie aeree sono esposti a un colorante tracciante fluorescente, Fast Blue, per il tracciamento retrograda di specifiche vie aeree nodose neuroneS. I gangli nodose sono dissociate e la fluorescenza delle cellule attivate (FAC) l'ordinamento viene utilizzato per raccogliere le cellule positive colorante. Successivamente, l'acido ribonucleico di alta qualità (RNA) viene estratto dalle cellule positive dye per la prossima generazione di sequenziamento. Utilizzando questo metodo vie aeree specifica espressione genica neuronale è determinata.
Introduzione
nervi somatosensoriali trasdurre termica, meccanica, chimica, e stimoli nocivi causati da due agenti endogeni e ambientali. I corpi cellulari di questi nervi afferenti si trovano nei gangli sensoriali, come la radice dorsale, trigemino, o gangli nodoso. Ogni ganglion sensoriale innerva regioni specifiche del corpo e contiene cellule che innervano organi e tessuti separati all'interno di tale regione. Per esempio, i gangli delle radici dorsali (DRG) si trovano nella colonna vertebrale e estendere i processi in tutto il corpo e gli arti, mentre i gangli del trigemino si trova nel cranio, che contiene neuroni che innervano il viso, gli occhi, le meningi e vie aeree ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) della Duke University.
1. intranasale Amministrazione di Fast Blue
Per Fast Blue, amministrare il colorante almeno 2 giorni prima eutanasia il mouse. Il colorante persisterà fino a otto settimane.
- Anestetizzare il mouse con l'anestesia per inalazione di luce (2,5% sevoflurano) fino a quando inizia a rallentare la respirazione.
- Utilizzare una pipetta 200 ml con punte filtrati per infondere lentamente 40 ml di soluzione colorante (0.4 mm Fast Blue, 1% dimetilsolfossido, saline DMSO, in tampone fosfato, PBS) nel....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Utilizzando questo metodo, i neuroni delle vie respiratorie-innervano sono etichettati per via intranasale instillando Fast Blue (Figura 1A). Dopo due giorni, veloci cellule blu marcate appaiono nei gangli nodoso (Figura 1C). Queste cellule formano 3 - 5% della popolazione totale neuronale dei gangli nodose. Altri coloranti retrogrado che sono stati usati per questo scopo comprendono DII (1,1'-diottadecil-3,3,3 ', 3'-perclorato tetramethylind.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Questo protocollo descrive un metodo per indirizzare i neuroni delle vie aeree, che innervano nei gangli nodoso del nervo vago. Una volta etichettato, i gangli vengono delicatamente dissociate per conservare in modo ottimale il numero di cellule e la vitalità. Questi neuroni sono poi FAC allineati direttamente nel tampone di lisi e RNA viene estratto. Il significato di questo protocollo è la possibilità di individuare, isolare e preservare la qualità di una specifica popolazione di cellule sensoriali. L'espressione .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Supportato da NIH concedere R01HL105635 a SEJ. Gli autori desiderano ringraziare Diego V. Bohórquez consulenza tecnica. Ringraziamo anche R. Ian Cumming per l'assistenza tecnica e l'esecuzione della citometria a flusso al Duke Vaccine umana Research Institute citometria a flusso Shared Resource Facility (Durham, NC). La citometria a flusso è stato eseguito nel Laboratorio biocontenimento regionale presso la Duke, che ha ricevuto il supporto parziale per la costruzione dal National Institutes of Health, National Institute of Allergy e Malattie infettive (UC6-AI058607).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Veloce Blu | Poliscienze, Inc. | 17740-2 | stock 2 mg/ml in acqua |
| NeuroTrace 530/615 rosso Nissle colorante | Life Technologies | N21482 | |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (PBS) Ca e Mg free | Gibco | 14190-144 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| glutammina ( Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 (senza vitamina A) | Gibco | 12587-010 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 &; g/ml in PBS/10% FBS |
| enzima di digestione, Liberase DH Research Grade | Roche | 5401054001 | stock 2,5 mg/ml in soluzione di particelle d'acqua |
| (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
| Blocco riscaldante | LabNet | ||
| 70 &; filtro cellulare m | Falcon | 352350 | |
| Etanolo assoluto (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| Acqua priva di RNasi | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
| Reagente di decontaminazione con RNasi, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
| 2-mercaptoetanolo | VWR | EM-6010 | |
| Kit di estrazione dell'RNA, RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| Kit DNasi, senza RNasi DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| DNasi | Sigma | D5025-15KU | stock 10 mg/ml in 0,15 M NaCl |
| Propidio Ioduro | Sigma | P4170-10MG | stock 10 &; g/ml in PBS |
| Sistema di elettroforesi microfluidica (TapeStation 2200) | Agilent |
Riferimenti
- Manteniotis, S., et al. Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia. PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).
- Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
Esplora altri articoli
Neuroni che innervano le vie aereeisolamento dei gangli nodositracciamento con Fast Bluesmistamento cellulare attivato da fluorescenzadissoluzione dei ganglicentrifugazione a gradiente di densitàprotocollo di estrazione dell'RNAelettroforesi microfluidicaneuroni afferenti vagalineurobiologia periferica
