Метод к цели и изолят Airway-иннервирующих сенсорные нейроны у мышей
Summary
Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.
Abstract
Соматосенсорные нервы трансдукции тепловые, механические, химические и вредные стимулы, вызванные как эндогенных, так и факторов окружающей среды. Клеточные тела этих афферентных нейронов расположены в пределах сенсорных ганглиев. Сенсорных ганглиев иннервируют конкретный орган или часть тела. Например, ганглии задних корешков (DRG) расположены в позвоночнике и расширить процессы по всему телу и конечностям. Тройничного ганглиев расположены в черепе и иннервируют лицо и верхние дыхательные пути. Вагусными афференты в Узловые ганглиев распространяются на протяжении кишечника, сердца и легких. В Узловые нейроны контролируют широкий спектр функций, таких как: частота дыхания, раздражение дыхательных путей и кашель рефлексов. Таким образом, чтобы понять и манипулировать их функции, крайне важно, чтобы идентифицировать и изолировать в дыхательных путях конкретных нейронные субпопуляции. У мышей, дыхательные пути подвергаются флуоресцентного индикаторного красителя, Fast Blue, для ретроградного отслеживании в дыхательных путях специфических нодозного нейронеs. В Узловые ганглиев разобщены и флуоресценции активированных клеток (FAC) сортировка используется для сбора красителей положительных клеток. Далее, высокое качество рибонуклеиновой кислоты (РНК) извлекается из красителя положительных клеток к следующей последовательности поколения. С помощью этого метода дыхательные пути определяется специфическая экспрессия гена нейронный.
Introduction
Соматосенсорные нервы трансдукции тепловые, механические, химические и вредные стимулы, вызванные как эндогенных, так и факторов окружающей среды. Клеточные тела этих афферентных нервов расположены в сенсорных ганглиев, таких как спинной корень, невралгии тройничного или нодозного ганглиев. Каждая сенсорная ганглий иннервирует конкретных областей тела и содержит клетки, которые возбуждают отдельные органы и ткани в этом регионе. Например, ганглии задних корешков (DRG) расположены в позвоночнике и расширить процессы по всему телу и конечностям, в то время как тройничный ганглии расположены в черепе, содержащий нейроны, иннервирующие лицо, глаза, мозговые оболочки или верхние дыхательные пути 1, 2. Узловатый ганглии блуждающего нерва находится в области шеи ниже черепа и содержит тела клеток , которые проходят нервные волокна в течение всего желудочно – кишечного тракта, сердца, и нижние дыхательные пути и легкие 3. У человека узловатый ганглий стоит особняком, однако, у мышей он слитс яремной ганглия, который также иннервирует легкие 4. Этот слитый ганглий часто называют яремной / узловатый комплекс, блуждающего ганглий, или просто узловатый ганглий 5. Здесь он упоминается как нодозного ганглия.
Афферентные волокна узловатый передают информацию от внутренностей к ядру одиночного пути (NTS) в стволе головного мозга. Сенсорное вход в этот уникальный ганглии управляет множеством разнообразных функций, таких как кишок 6, частота сердечных сокращений, дыхания 7 8,9, и раздражающих активированные респираторных реакций 10,11. С этим разнообразием функций и иннервируемых органов, крайне важно, чтобы цели и выделить специфические для органа субпопуляций нодозного ганглии с целью изучения отдельных нейронных путей. Однако, учитывая небольшой размер узловатый и ограниченное число нейронов она содержит это не является тривиальной задачей. Каждая мышь узловатый ганглий содержит примерно 5000 нейронов 12в дополнение к обширной популяции поддержки сателлитных клеток. Из 5000 узловатый нейронов, только 3 – 5% иннервируют дыхательные пути. Таким образом, любые функциональные, морфологические или молекулярные изменения в пределах воздушной трассы-иннервирующих нейронов, из-за стимуляции дыхания или патологий, будут потеряны в плотно упакованной нодозного ганглии.
Чтобы решить эту проблему, был разработан метод, чтобы идентифицировать и изолировать нейроны, которые иннервируют дыхательные пути. Дыхательные подвергались воздействию флуоресцентного индикаторного красителя, чтобы идентифицировать последующие нейроны иннервирующих узловатый. Быстрый Синий подхватили нейронов и быстро перемещается к их клеточных тел , где она сохраняется до восьми недель 13 – 15. После идентификации, мягкий, но эффективный, протокол диссоциации был использован для сохранения маркировки красителя и жизнеспособность клеток для люминесцентной активированной клетки (FAC) сортировочный. Отсортированные клетки используются для извлечения высокого качества рибонуклеиновой кислоты (РНК) для определения экспрессии гена или Fили другой вниз по течению молекулярного анализа. Этот протокол обеспечивает полезный и надежный метод для изоляции сенсорных нейронов, иннервирующих ткани интереса.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает метод целевому дыхательные пути-иннервирующих нейроны в нодозного ганглии блуждающего нерва. После того, как меченый, ганглиях мягко диссоциированных оптимально сохранить количество клеток и жизнеспособность. Эти нейроны затем КВС сортируются непосредствен?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
При поддержке NIH грант R01HL105635 к SEJ. Авторы хотели бы поблагодарить Диего В. Бохоркез за технической консультацией. Мы также благодарим Р. Ян Камминг за техническую помощь и выполнение проточной цитометрии на Duke человеческих вакцин Научно-исследовательский институт проточной цитометрии совместно используемых ресурсов фонда (Durham, NC). Проточной цитометрии проводили в биоизоляции лаборатории регионального Дюка, который получил частичную поддержку строительства от Национальных институтов здравоохранения, Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний (UC6-AI058607).
Materials
| Fast Blue | Polysciences, Inc. | 17740-2 | stock 2 mg/ml in water |
| NeuroTrace 530/615 red Nissle stain | Life Technologies | N21482 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free | Gibco | 14190-144 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| glutamine (Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 (no vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS |
| digestion enzyme, Liberase DH Research Grade | Roche | 5401054001 | stock 2.5 mg/ml in water |
| particle solution (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
| Heating block | LabNet | ||
| 70 um cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| RNase free water | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
| RNase decontamination reagent, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
| 2-mercaptoethanol | VWR | EM-6010 | |
| RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| DNase kit, RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| DNase | Sigma | D5025-15KU | stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | stock 10 µg/ml in PBS |
| Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) | Agilent |
Riferimenti
- Manteniotis, S., et al. Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia. PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).
- Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse. BMC Neurosci. 14 (1), 21 (2013).
- Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).
- Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia. J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).
- Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways. J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).
- Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).
- Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J. Neurochemistry of the nodose ganglion. Prog Neurobiol. 52 (2), 79-107 (1997).
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing. Cell. 161, 1-12 (2015).
- Kaczyńska, K., Szereda-Przestaszewska, M. Nodose ganglia-modulatory effects on respiration. Physiol Res. 62, 227-235 (2013).
- Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents. Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).
- Bautista, D. M., et al. TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).
- Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin. Neuroscienze. 137 (2), 531-536 (2006).
- Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Res. 1319, 60-69 (2010).
- Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neuroscienze. 49 (3), 715-737 (1992).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).
- Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat. J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).
- Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels. J Vis Exp. (82), e50782 (2013).
- Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus. Am J Physiol – Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).
- Kwong, K., Lee, L. -. Y. PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli. J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).
- Joachim, R. A., et al. Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways. Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).
- Kaan, T. K. Y., et al. Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats. Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).
- Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon. Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).
- Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).
