حصاد الانتقائي للMarginating-الكبدية الكريات البيضاء
Summary
Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.
Abstract
Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.
Introduction
الجيوب الكبد تحتوي على العديد من الأنواع الفرعية الكريات البيض لمختلف الأنشطة المناعي شديدة الأهمية للكائن الحي. على سبيل المثال، تتميز marginating الكبدي (MH) القاتلة الطبيعية (NK) الخلايا، التي تعرف أيضا باسم الخلايا حفرة، الخلايا الليمفاوية الحبيبية شكليا الكبيرة و(LGLs) وظيفيا كما الكريات البيض مع قدرة السامة للخلايا عفوية، مما الكبدي المقاومة ضد إنشاء بالدم الانبثاث ورم المنقولة. الهدف من الطريقة المعروضة هنا هو تمكين الحصاد الانتقائي من الكريات البيض MH، من أجل دراسة هذه الفئة من السكان الخلية مهم وفريد (ومقصورة المناعة)، وإلقاء الضوء على تأثير مختلف التلاعب (على سبيل المثال تنشيط جهاز المناعة) على هذه الخلايا المحددة.
وعلى الرغم من عدم الحصانة للقضاء على الورم الرئيسي النامية، الأدلة في مرضى السرطان والنماذج الحيوانية تشير إلى أن نظام المناعة يمكن التحكم تعميم الخلايا السرطانية، micrometastases، والمرض المتبقية throuغ مناعة خلوية (CMI). ومع ذلك، هناك عدم تناسق واضح بين هذه القدرات في الجسم الحي والدراسات المختبرية في البشر والحيوانات، والتي تثبت أن معظم الخلايا السرطانية ذاتي مقاومة لسمية الخلايا من خلال تعميم أو الكريات البيضاء الطحال 1،2. قد يعزى هذا التناقض، جزئيا على الأقل، إلى وجود في الجسم الحي من جزء من السكان الكريات البيض متميزة، وهي (الجيوب) الكريات البيض-marginating الكبد وحيوانية من خلايا NK تفعيلها، وهي خلايا حفرة 3. في الواقع، تشير بيانات غير منشورة من مختبرنا أنه في الفئران F344 كانت هي lysed الخلايا السرطانية مسانج (MADB106)، التي وجدت مقاومة للتعميم والطحال الكريات البيضاء، خلايا MH-NK 4. وهكذا، الخلايا السرطانية التي هي "مقاومة NK" بزعم الكريات البيض تعميم يمكن التحكم بها عن خلايا MH-NK. الجدير بالذكر، في الفئران النشاط المعزز للMH-NK هو واضح التالية فقط في الجسم الحي المناعةالتحفيز (على سبيل المثال من خلال استخدام بولي الأول: C أو الدليل السياسي الشامل-C) 5.
تقع الخلايا القاتلة الطبيعية الكبد معين (MH-NK) داخل التجويف الجيبية، والتمسك الخلايا البطانية وخلايا كوبفر. وتتميز الخلايا MH-NK حصرا حبيبات كثيفة كروية والحويصلات محفور قضيب 6، والتي تحتوي على حمض الفوسفاتيز كما الانزيمات الليزوزومية، وبيرفورين وgranzymes كما المواد النشطة بيولوجيا 7،8. مقارنة مع تعميم الخلايا القاتلة الطبيعية، والخلايا MH-NK يحمل عددا أكبر وحجم الحبيبات والحويصلات 9-11. في ظل ظروف التهابات، وعرضت خلايا MH-NK لعرض تعبير أعلى من LFA-1 12، بالمقارنة مع تعميم الخلايا القاتلة الطبيعية. قد يشكل هذا التعبير تعزيز الآلية التي الخلايا MH-NK هي أكثر السامة للخلايا ضد الخلايا السرطانية بعض من تعميم الخلايا القاتلة الطبيعية 13،14. nterestingly بعد في المختبر الحضانة مع انترلوكين (ايل) -2، وخلايا MH-NK تصبح الموسع، وعدد وحجم حبيبات زيادة، والتي تنسجم مع الموالية فاي لو القاتل تنشيط مفوكين (LAK) خلايا (15).
الكريات البيض MH النشطة لا يمكن الحصول عليها إلا عن طريق أساليب حصاد الكريات البيض الكبد القياسية، والتي تقوم على طحن وتدهور البيولوجي في الأنسجة. نهج نضح لدينا الموصوفة هنا اثنين من المزايا الرئيسية مقارنة بالاساليب التقليدية. أولا، النهج نضح يحصد انتقائي الكريات البيض MH، ومنع التلوث الكريات البيض أخرى من المقصورات الكبد الأخرى. ثانيا، تقنية نضح أفضل تحافظ على سلامة والنشاط، والوسط الفسيولوجية من الكريات البيض MH، على عكس النهج معالجة الأنسجة التي تتلف الخلايا أو يغير التشكل، ويرجع ذلك إلى تلف الأنسجة، تحفز إطلاق سراح من العوامل المختلفة التي تعدل بشكل ملحوظ في مأمن نشاط.
الكبد هو العضو المستهدف الرئيسي لسرطان خبيث لالثانية لمختلف العدوى 16. كخلايا MH يحمل خصائص فريدة من المهم دراسة هذه سكانية محددة في ظل ظروف مختلفة فيما يتعلق بهذه الأمراض. على سبيل المثال، فإنه تجدر الإشارة إلى أن تنشيط جهاز المناعة النظامية من قبل مختلف BRMS (مثل بولي الأول: C أو الدليل السياسي الشامل-C) وقد ثبت أن تفعيل MH-الكريات البيض أكثر من تعميم الكريات البيض 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
طريقة نضح الكبد المقدمة هنا تمكن حصاد انتقائي وتدرس من السكان فريدة من marginating الكريات البيض الكبد. خلايا الكبد NK، وتسمى أيضا خلايا حفرة 3، تشكل المميز السكان الخلايا القاتلة الطبيعية الموجودة في الجيوب الكبدية. فهي موجودة في الفئران، الفئران 17 وفي البشر <s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors and this work were supported by NIH/NCI grant # R01CA172138 (to SBE).
Materials
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26G | |
| Butterfly needle | OMG | 21G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| 22W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp |
Riferimenti
- Melamed, R., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells. J Immunother. 33, 16-29 (2010).
- Benish, M., Melamed, R., Rosenne, E., Neeman, E., Sorski, L., Levi, B., Shaashua, L., Matzner, M., Ben-Eliyahu, S. The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics. Immunologic Research. 58, 28-39 (2014).
- Wisse, E., van’t Noordende, J. M., van der Meulen, J., Daems, W. T. The pit cell: description of a new type of cell occurring in rat liver sinusoids and peripheral blood. Cell Tissue Res. 173, 423-435 (1976).
- Vermijlen, D., et al. Hepatic natural killer cells exclusively kill splenic/blood natural killer-resistant tumor cells by the perforin/granzyme pathway. J Leukoc Biol. 72, 668-676 (2002).
- Gao, B., Radaeva, S., Park, O. Liver natural killer and natural killer T cells: immunobiology and emerging roles in liver diseases. J Leukoc Biol. 86, 513-528 (2009).
- Kaneda, K. Liver-associated large granular lymphocytes: morphological and functional aspects. Arch Histol Cytol. 52, 447-459 (1989).
- Podack, E. R., Hengartner, H., Lichtenheld, M. G. A central role of perforin in cytolysis?. Annu Rev Immunol. 9, 129-157 (1991).
- Kamada, M. M., et al. Identification of carboxypeptidase and tryptic esterase activities that are complexed to proteoglycans in the secretory granules of human cloned natural killer cells. J Immunol. 142, 609-615 (1989).
- Wisse, E., et al. On the function of pit cells, the liver-specific natural killer cells. Semin Liver Dis. 17, 265-286 (1997).
- Bouwens, L., Remels, L., Baekeland, M., Van Bossuyt, H., Wisse, E. Large granular lymphocytes or "pit cells" from rat liver: isolation, ultrastructural characterization and natural killer activity. Eur J Immunol. 17, 37-42 (1987).
- Vanderkerken, K., et al. Origin and differentiation of hepatic natural killer cells (pit cells). Hepatology. 18, 919-925 (1993).
- Luo, D., et al. The role of adhesion molecules in the recruitment of hepatic natural killer cells (pit cells) in rat liver. Hepatology. 24, 1475-1480 (1996).
- Shresta, S., MacIvor, D. M., Heusel, J. W., Russell, J. H., Ley, T. J. Natural killer and lymphokine-activated killer cells require granzyme B for the rapid induction of apoptosis in susceptible target cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 5679-5683 (1995).
- Luo, D., et al. Involvement of LFA-1 in hepatic NK cell (pit cell)-mediated cytolysis and apoptosis of colon carcinoma cells. J Hepatol. 31, 110-116 (1999).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of mouse liver-associated natural killer activity by biologic response modifiers occurs largely via rapid recruitment of large granular lymphocytes from the bone marrow. J Immunol. 143, 372-378 (1989).
- Schluter, K., et al. Organ-specific metastatic tumor cell adhesion and extravasation of colon carcinoma cells with different metastatic potential. Am J Pathol. 169, 1064-1073 (2006).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of organ-associated natural killer activity by biological response modifiers. Isolation and characterization of large granular lymphocytes from the liver. J Exp Med. 160, 1431-1449 (1984).
- Winnock, M., et al. Functional characterization of liver-associated lymphocytes in patients with liver metastasis. Gastroenterology. 105, 1152-1158 (1993).
- Hata, K., et al. Isolation, phenotyping, and functional analysis of lymphocytes from human liver. Clin Immunol Immunopathol. 56, 401-419 (1990).
- Vanderkerken, K., Bouwens, L., Wisse, E. Characterization of a phenotypically and functionally distinct subset of large granular lymphocytes (pit cells) in rat liver sinusoids. Hepatology. 12, 70-75 (1990).
- Sorski, L., Melamed, R., Lavon, H., Matzner, P., Rosenne, E., Ben-Eliyahu, S. . , (2015).
