Selektive Ernte von Marginating-Leber-Leukozyten
Summary
Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.
Abstract
Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.
Introduction
Die Lebersinusoide enthalten zahlreiche Leukozytensubtypen verschiedener Immunaktivitäten entscheidend für den Organismus. Zum Beispiel marginating Leber (MH) natürliche Killerzellen (NK), die auch als Pit-Zellen bekannt sind, charakterisiert morphologisch als große granuläre Lymphozyten (LGLs) und funktionell als Leukozyten mit spontaner zytotoxische Kapazität, so dass Leber-Widerstand gegen die Errichtung von blut- getragen Tumormetastasen. Das Ziel des Verfahrens vorgestellt hierin selektive Ernte von MH Leukozyten zu aktivieren, um diese wichtige und einzigartige Zellpopulation zu untersuchen (und Immunraum), und die Auswirkungen der verschiedenen Manipulationen (beispielsweise Immunaktivierung) auf diesen spezifischen Zellen aufzuklären.
Trotz des Ausfalls der Immunität eines Entwicklungsprimärtumor, Nachweis bei Krebspatienten und Tiermodelle zu eliminieren, zeigen an, dass das Immunsystem zirkulierende Tumorzellen steuern können, Mikrometastasen und residual disease through zellvermittelte Immunität (CMI). Es gibt jedoch eine scheinbare Unstimmigkeit zwischen diesen in vivo – Funktionen und in vitro – Studien in Menschen und in Tieren, die zeigen , dass die meisten autologe Tumorzellen – Zytotoxizität durch zirkulierende oder splenic Leukozyten 1,2 resistent sind. Diese Inkonsistenz kann zurückgeführt werden, zumindest teilweise auf die in vivo Existenz einer deutlichen Leukozytensubpopulation, nämlich die marginating-hepatische (Sinusoide) Leukozyten und deren Subpopulation von aktivierten NK – Zellen, nämlich pit Zellen 3. Tatsächlich unpublizierte Daten aus unserem Labor zeigten , daß in F344 Ratten syngene Tumorzellen (MADB106), das Zirkulieren und splenic Leukozyten resistent gefunden, 4 durch MH-NK Zellen lysiert wurden. Somit Tumorzellen, die angeblich "NK-resistant" auf zirkulierende Leukozyten sind, können durch MH-NK-Zellen gesteuert werden. Bemerkenswert ist die verstärkte Aktivität von MH-NK bei Mäusen in vivo nach nur offensichtlich immunStimulation (zB durch die Verwendung von Poly I: C oder CpG-C) 5.
Leberspezifischen NK-Zellen (MH-NK) innerhalb der sinusförmigen Lumens befindet, an die Endothelzellen und Kupffer-Zellen anhaften. MH-NK – Zellen werden durch sphärische dichten Granula und stäbchen entkernt Vesikeln 6, die enthalten saure Phosphatase als lysosomale Enzyme und Perforin und Granzyme als bioaktive Substanzen 7,8 ausschließlich aus. Verglichen mit NK – Zellen zirkulierende weisen MH-NK – Zellen eine höhere Anzahl und Größe der Granula und Vesikel 9-11. Unter entzündlichen Bedingungen wurden MH-NK – Zellen gezeigt höhere Expression von LFA-1 12 aufweisen, im Vergleich zu den NK – Zellen zirkulieren. Diese erhöhte Expression könnte einen Mechanismus dar , mit dem MH-NK – Zellen mehr zytotoxischen gegen bestimmte Tumorzellen sind als NK – Zellen 13,14 zirkuliert. nterestingly nach in vitro – Inkubation mit Interleukin (IL) -2, werden MH-NK – Zellen vergrößert undihre Anzahl und Größe der Körner zu erhöhen, die alle mit einem Pro fi l von Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK) 15 konsistent sind.
Aktive MH Leukozyten kann nicht ausschließlich durch die Standard Leber Leukozyten Ernteverfahren erhalten werden, die auf Schleif- und biologischen Abbau des Gewebes beruhen. Unser Perfusion Ansatz hier beschriebenen hat zwei wesentliche Vorteile im Vergleich zu den Standard-Ansätzen. Erstens, erntet die Perfusion Ansatz selektiv MH Leukozyten, Verunreinigungen durch andere Leukozyten aus anderen Leberfächer zu verhindern. Zweitens behält die Perfusionstechnik besser, die Integrität, die Aktivität und die physiologischen Milieu MH Leukozyten, im Gegensatz zu der Gewebeverarbeitung dass Zellen schädigen nähert oder ihre Morphologie zu verändern, und aufgrund von Gewebeschäden induzieren die Freisetzung von verschiedenen Faktoren, die deutlich immune modulieren Aktivität.
Die Leber ist ein wichtiges Zielorgan für die Krebsmetastasierung and für verschiedene Infektionen 16. Als MH-Zellen einzigartige Eigenschaften aufweisen, ist es wichtig, diese spezifische Population unter verschiedenen Bedingungen in bezug auf diese Pathologien zu studieren. Zum Beispiel ist es angemessen , dass die systemische Immunaktivierung durch verschiedene BRMs (zB Poly I: C oder CpG-C) zu beachten sind MH-Leukozyten gezeigt mehr zu aktivieren , als Leukozyten 5 zirkuliert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Methode Leberperfusion hier vorgestellten ermöglicht eine selektive Ernte und das Studium der einzigartigen Population von marginating Leber Leukozyten. Leber NK – Zellen, auch Grube Zellen 3 genannt, bilden eine unverwechselbare NK – Zellpopulation , die in den Leber sinusoids befinden. Sie werden bei Ratten, Mäusen 17 und beim Menschen 18,19 gefunden. Im Vergleich zu isolierten peripheren NK – Zellen zeigte pit Zellen höhere Zytotoxizität gegen YAC-1 und CC531s Zielzelllinien <…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors and this work were supported by NIH/NCI grant # R01CA172138 (to SBE).
Materials
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26G | |
| Butterfly needle | OMG | 21G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| 22W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp |
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