Selektiv Høsting av Marginating-lever Leukocytter
Summary
Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.
Abstract
Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.
Introduction
Leveren sinusoids inneholder mange leukocytter subtyper av ulike immun aktiviteter kritiske til organismen. For eksempel er marginating lever (MH) naturlige dreperceller (NK) celler, også kjent som pit-celler, karakterisert morfologisk som store granulære lymfocytter (LGLs) og funksjonelt som leukocytter med spontan cytotoksisk kapasitet, slik at hepatisk-motstand mot etablering av blod- båret tumormetastaser. Målet med fremgangsmåten presentert heri er å muliggjøre selektiv høsting av MH leukocytter, for å studere dette viktig og unikt cellepopulasjon (og immun rommet), og for å belyse virkningen av forskjellige manipuleringer (for eksempel aktivering av immunsystemet) på følgende spesifikke celler.
Til tross for svikt i immunitet for å eliminere en utvikling av primær tumor, bevis på kreftpasienter og dyreforsøk tyder på at immunsystemet kan kontrollere sirkulerende tumorceller, mikrometastaser, og restsykdom igjennomgh cellemediert immunitet (CMI). Men det er en tilsynelatende uoverensstemmelse mellom disse in vivo-egenskapene og in vitro studier i mennesker og i dyr, som viser at de fleste autologe tumorceller er motstandsdyktig mot cytotoksisitet av sirkulerende leukocytter eller milt 1,2. Denne uoverensstemmelse kan skyldes, i det minste delvis, til det in vivo eksistensen av en distinkt leukocytt subpopulasjon, nemlig marginating-lever (sinus) leukocytter og deres subpopulasjon av aktiverte NK-celler, nemlig cellene 3 gropen. Faktisk, upubliserte data fra vårt laboratorium indikerte at i F344 rotter syngeniske tumorceller (MADB106), som ble funnet å være resistent til sirkulerende leukocytter og milt, ble lysert ved MH-NK-celler 4. Således kan tumorceller som er angivelig "NK-resistente" for å sirkulerende leukocytter bli styrt av MH-NK-celler. Merke, i mus den forbedrede aktivitet av MH-NK er åpenbart bare følgende in vivo immunstimulering (for eksempel ved bruk av Poly I: C eller CpG-C) 5.
Lever-spesifikke NK-celler (MH-NK) ligger inne i sinus lumen, å følge endotelceller og Kupffer celler. MH-NK-celler er utelukkende kjennetegnet ved tette sfæriske granuler og stangkjerne vesikler 6, som inneholder sur fosfatase som lysosomale enzymer og perforin og granzymes som bioaktive stoffer 7,8. Sammenlignet med sirkulerende NK-celler, MH-NK-celler utviser et høyere antall og størrelse av granuler og vesikler 9-11. Under inflammatoriske tilstander, ble MH-NK-celler er vist å oppvise høyere ekspresjon av LFA-1-12, sammenlignet med sirkulerende NK-celler. Denne forbedrede ekspresjon kan utgjøre en mekanisme ved hvilken MH-NK-celler er mer cytotoksisk mot visse tumorceller enn sirkulerende NK-celler 13,14. nterestingly etter in vitro inkubering med interleukin (IL) -2, MH-NK-celler blir forstørret, ogderes antall og størrelse på granulater øke, som alle er i samsvar med en pro fi le av lymfokin-aktivert drapsmann (LAK) celler 15.
Aktive MH leukocytter ikke kan utelukkende oppnås gjennom standard leveren leukocytt høstemetoder, som er basert på slipe- og biologisk nedbrytning av vev. Vår perfusjon metode som her er beskrevet har to viktige fordeler sammenlignet med de vanlige tilnærminger. Først perfusjon tilnærming selektivt høster MH leukocytter, forebygge forurensning av andre leukocytter fra andre lever avdelinger. For det andre perfusjon teknikken bedre bevarer integriteten, aktiviteten, og den fysiologiske miljøet i MH leukocytter, i motsetning til vevet behandling tilnærminger som skader cellene eller endre deres morfologi, og på grunn av vevsskade, indusere frigjørelsen av forskjellige faktorer som markert modulere immun aktivitet.
Leveren er et viktig målorgan for cancer metastase ennd for ulike infeksjoner 16. Som MH celler oppviser unike egenskaper er det viktig å studere denne bestemt populasjon under forskjellige betingelser med hensyn til disse patologiene. For eksempel, er det verd å merke seg at systemisk aktivering av immunsystemet ved hjelp av forskjellige BRM (f.eks poly I: C eller CpG-C) er blitt vist å aktivere MH-leukocytter mer enn 5 sirkulerende leukocytter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Leveren perfusjon metoden som presenteres her gir en selektiv høsting og studere av den unike befolkningen i marginating lever leukocytter. Lever NK-celler, også kalt pit celler 3, utgjør en særegen NK celle befolkningen som bor i hepatiske sinusoids. De er funnet i rotter, mus 17 og i mennesker 18,19. Sammenlignet med isolerte perifere NK-celler, pit-celler demonstrerte høyere cytotoksisitet mot YAC-1 og CC531s target cellelinjer 20, ble vist å ha et større antall mind…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors and this work were supported by NIH/NCI grant # R01CA172138 (to SBE).
Materials
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26G | |
| Butterfly needle | OMG | 21G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| 22W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp |
Riferimenti
- Melamed, R., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells. J Immunother. 33, 16-29 (2010).
- Benish, M., Melamed, R., Rosenne, E., Neeman, E., Sorski, L., Levi, B., Shaashua, L., Matzner, M., Ben-Eliyahu, S. The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics. Immunologic Research. 58, 28-39 (2014).
- Wisse, E., van’t Noordende, J. M., van der Meulen, J., Daems, W. T. The pit cell: description of a new type of cell occurring in rat liver sinusoids and peripheral blood. Cell Tissue Res. 173, 423-435 (1976).
- Vermijlen, D., et al. Hepatic natural killer cells exclusively kill splenic/blood natural killer-resistant tumor cells by the perforin/granzyme pathway. J Leukoc Biol. 72, 668-676 (2002).
- Gao, B., Radaeva, S., Park, O. Liver natural killer and natural killer T cells: immunobiology and emerging roles in liver diseases. J Leukoc Biol. 86, 513-528 (2009).
- Kaneda, K. Liver-associated large granular lymphocytes: morphological and functional aspects. Arch Histol Cytol. 52, 447-459 (1989).
- Podack, E. R., Hengartner, H., Lichtenheld, M. G. A central role of perforin in cytolysis?. Annu Rev Immunol. 9, 129-157 (1991).
- Kamada, M. M., et al. Identification of carboxypeptidase and tryptic esterase activities that are complexed to proteoglycans in the secretory granules of human cloned natural killer cells. J Immunol. 142, 609-615 (1989).
- Wisse, E., et al. On the function of pit cells, the liver-specific natural killer cells. Semin Liver Dis. 17, 265-286 (1997).
- Bouwens, L., Remels, L., Baekeland, M., Van Bossuyt, H., Wisse, E. Large granular lymphocytes or "pit cells" from rat liver: isolation, ultrastructural characterization and natural killer activity. Eur J Immunol. 17, 37-42 (1987).
- Vanderkerken, K., et al. Origin and differentiation of hepatic natural killer cells (pit cells). Hepatology. 18, 919-925 (1993).
- Luo, D., et al. The role of adhesion molecules in the recruitment of hepatic natural killer cells (pit cells) in rat liver. Hepatology. 24, 1475-1480 (1996).
- Shresta, S., MacIvor, D. M., Heusel, J. W., Russell, J. H., Ley, T. J. Natural killer and lymphokine-activated killer cells require granzyme B for the rapid induction of apoptosis in susceptible target cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 5679-5683 (1995).
- Luo, D., et al. Involvement of LFA-1 in hepatic NK cell (pit cell)-mediated cytolysis and apoptosis of colon carcinoma cells. J Hepatol. 31, 110-116 (1999).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of mouse liver-associated natural killer activity by biologic response modifiers occurs largely via rapid recruitment of large granular lymphocytes from the bone marrow. J Immunol. 143, 372-378 (1989).
- Schluter, K., et al. Organ-specific metastatic tumor cell adhesion and extravasation of colon carcinoma cells with different metastatic potential. Am J Pathol. 169, 1064-1073 (2006).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of organ-associated natural killer activity by biological response modifiers. Isolation and characterization of large granular lymphocytes from the liver. J Exp Med. 160, 1431-1449 (1984).
- Winnock, M., et al. Functional characterization of liver-associated lymphocytes in patients with liver metastasis. Gastroenterology. 105, 1152-1158 (1993).
- Hata, K., et al. Isolation, phenotyping, and functional analysis of lymphocytes from human liver. Clin Immunol Immunopathol. 56, 401-419 (1990).
- Vanderkerken, K., Bouwens, L., Wisse, E. Characterization of a phenotypically and functionally distinct subset of large granular lymphocytes (pit cells) in rat liver sinusoids. Hepatology. 12, 70-75 (1990).
- Sorski, L., Melamed, R., Lavon, H., Matzner, P., Rosenne, E., Ben-Eliyahu, S. . , (2015).
