Ved hjælp af en Laminering teknik til at udføre Konfokal mikroskopi af det menneskelige Sclera
Summary
Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used.
Abstract
Sclera er et tæt bindevæv, der dækker og beskytter øjet. Den består hovedsageligt af tætte kollagen bundter (type I, III, IV, V, VI, og VII). På grund af sin autofluorescens, uigennemsigtighed, og tykkelse, har det ikke vist sig egnet til konfokal mikroskopi. En alternativ fremgangsmåde til den, der præsenteres her, som bruger formalinfikseret sclera indlejret i paraffin for immunhistokemi, har tekniske udfordringer, især når forvarmning af væv til antigen-genvinding. Da sclera er relativt fattige i begge celler og fartøjer, blev brugen af større vævsprøver undersøges for at hjælpe med at forhindre udsigt celler og til at forstå deres lokalisering i forhold til skibe og andre anatomiske steder. At muliggøre analyse af større vævsprøver under det konfokale mikroskop, blev en laminering teknik udføres for at skabe tynde lag fra sclera. Ifølge analysen af resultaterne af CD31 blodkar og lymfekar endotel hyaluRonan receptor 1 (LYVE1) positive celler, hvor der blev opnået godkendelse til videnskabelig undersøgelse, fordele og begrænsninger ved denne metode diskuteres.
Introduction
Sclera er det stive ydre lag, der dækker øjet, som er lavet af tæt bindevæv. Det hjælper til at beskytte intraokulære strukturer og opretholde det intraokulære tryk. Således sclera er absolut nødvendige for klart udsyn. Det er blottet for lymfekar 1,2 og derved danner en ydre lymfatisk-fri grænse mellem den og lymfe-fri indre øje 3-7. Det giver også bindingssteder for ekstraokulære muskler og derved deler anatomiske ligheder med sener. Fordi sclera består hovedsageligt af tætte bundter af type I collagen og har et mindre antal kollagentyper III, IV, V, VI, VIII 8,9 og elastin 10,11, dette væv er ikke let at bruge for immunhistokemi.
Anatomisk, kan sclera opdeles i tre hovedlag: (1) den overfladiske vaskulariserede episclera, fundet under bindehinden og Tenons kapsel og mod siderne og the bagsiden af øjet overfor kredsløb; (2) den sclerale stroma, den vigtigste del af sclera; og (3) lamina fusca, som er en tynd, pigmenteret lag placeret direkte over uvea. Vores anatomiske viden om sclera stammer hovedsageligt fra den første halvdel af det 20. århundrede. På det tidspunkt, forskerne studeret anatomi vaskulatur hovedsageligt ved hjælp af Indien blæk injektioner 12 og vaskulær støbning 13-15. Senere blev det undersøgt i angiografiske undersøgelser 16-19.
Siden den tid har de ældre teknikker blevet forbedret og nye er blevet udviklet, som har givet os mulighed for at supplere tidligere anatomiske viden. For eksempel har det kun været omkring ti år siden vi har haft sådanne pålidelige lymfatiske markører som lymfatisk vaskulært endotel specifik hyaluronan receptor-1 (LYVE1) 20 eller podoplanin 21. Konfokal mikroskopi giver nye muligheder for at studere de anatomiske træk ved andet TIssues af øjet. Det giver mulighed for flere pletter, der skal anvendes til at differentiere markører af celler eller til lokalisering af celler i forhold til blodkar og andre anatomiske strukturer. Den giver et overblik, når prøven er af en større størrelse og giver os mulighed for at scanne gennem en prøve, når i jagten på en bestemt celletype. Med Z-Stack teknologi, kan konfokal mikroskopi anvendes til prøver op til 100-200 um. Sclera adskiller i tykkelse mellem 0,3 mm bag muskel indsætninger og 1 mm ved den bageste pol 11. På grund af både dens tykkelse og uigennemsigtighed, sclera er ikke egnet til konfokal mikroskopi under anvendelse af traditionelle metoder.
For at afhjælpe dette, blev sclerale væv lamineret for at muliggøre deres analyse med konfokal mikroskopi. Denne teknologi er nyttig til at opnå en bedre forståelse af både fysiologiske og patologiske situationer i den menneskelige sclera.
Protocol
Representative Results
Discussion
Laminering af menneskelige sclera er en fremgangsmåde til udførelse konfokal mikroskopi på dette væv. Et kritisk trin i denne proces er anvendelsen af ethanol i stedet for formalin til fastgørelse af væv. Det er vores erfaring, opnås bedre resultater, når anvendelse af ethanol i stedet for formalin til fiksering. Blunt skalpeller forværre den procedure og bør undgås. Ligeledes bør undgås udtørring af sclera, som det komplicerer proceduren og forringer kvaliteten af billederne.
<p class="jov…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
German Research Foundation (FOR2240 “(Lymph) Angiogenesis and Cellular Immunity in Inflammatory Diseases of the Eye” to CC and LMH; HE 6743/2-1 and HE 7643/3-1 to LMH; CU47/6-1 to CC), German Cancer Aid (to LMH and CC), GEROK program University of Cologne (to SLS and LMH), and EU COST BM1302 “Joining Forces to Corneal Regeneration” (to CC).
Materials
| 96% ethanol | Merck Chemicals, Darmstadt, Germany | P075.4 | |
| binocular stereo microscope | Motic, Hongkong, China | n.a | |
| 26G needles | Terumo, Leuven, Belgium | 303800 | |
| 15.5mm trepan | Geuder, Heidelberg, Germany | n.a | |
| no.10 scalpel | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | 2E+08 | |
| ophthalmic scalpel micro feather | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | no. 7657BR | |
| CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human) | Dako, USA | IR610 | |
| LYVE1 antibody (polyclonal rabbit anti human) | Zytomed, Germany | RBK014-05 | |
| goat anti mouse FITC antibody | Sigma Aldrich, Steinheim, Germany | F0257 | |
| goat anti rabbit Cy3 antibody | Dianova, Germany | 111-165-003 | |
| Goat Serum normal | Dako, Glostrup, Denmark | X090710-8 | |
| DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335.1 | |
| microscope slides | Engelbrecht, Edermünde, Germany | WC7695002 | |
| Coverslips 24x24mm | Th. Gayer, Lohmar, Germany | 7695026 | |
| DAKO fluorescent mounting medium | DAKO, USA | S3023 | |
| LSM Meta 510 confocal microscopy | Carl Zeiss AG, Jena, Germany | n.a | |
Riferimenti
- Schlereth, S. L., et al. Enrichment of lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1)-positive macrophages around blood vessels in the normal human sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (2), 865-872 (2014).
- Schlereth, S. L., et al. Absence of lymphatic vessels in the developing human sclera. Exp Eye Res. 125, 203-209 (2014).
- Hos, D., Cursiefen, C. Lymphatic vessels in the development of tissue and organ rejection. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 119-141 (2014).
- Hos, D., Schlereth, S. L., Bock, F., Heindl, L. M., Cursiefen, C. Antilymphangiogenic therapy to promote transplant survival and to reduce cancer metastasis: what can we learn from the eye. Semin Cell Dev Biol. , (2014).
- Streilein, J. W. Immune privilege as the result of local tissue barriers and immunosuppressive microenvironments. Curr Opin Immunol. 5 (3), 428-432 (1993).
- Streilein, J. W., Niederkorn, J. Y. Induction of anterior chamber-associated immune deviation requires an intact, functional spleen. J Exp Med. 153 (5), 1058-1067 (1981).
- Streilein, J. W., Yamada, J., Dana, M. R., Ksander, B. R. Anterior chamber-associated immune deviation, ocular immune privilege, and orthotopic corneal allografts. Transplant Proc. 31 (3), 1472-1475 (1999).
- Keeley, F. W., Morin, J. D., Vesely, S. Characterization of collagen from normal human sclera. Exp Eye Res. 39 (5), 533-542 (1984).
- Lee, R. E., Davison, P. F. Collagen composition and turnover in ocular tissues of the rabbit. Exp Eye Res. 32 (6), 737-745 (1981).
- Moses, R. A., Grodzki, W. J., Starcher, B. C., Galione, M. J. Elastin content of the scleral spur, trabecular mesh, and sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 17 (8), 817-818 (1978).
- Foster, C. S., Sainz de la Maza, M. . The sclera. , (2012).
- Kiss, F. Der Blutkreislauf des Auges. Ophthalmologica. 106, 225 (1943).
- Ashton, N. Anatomical study of Schlemm’s canal and aqueous veins by means of neoprene casts. Part I. Aqueous veins. Br J Ophthalmol. 35 (5), 291-303 (1951).
- Ashton, N., Smith, R. Anatomical study of Schlemm’s canal and aqueous veins by means of neoprene casts. III. Arterial relations of Schlemm’s canal. Br J Ophthalmol. 37 (10), 577-586 (1953).
- Ashton, N. Anatomical study of Schlemm’s canal and aqueous veins by means of neoprene casts II. Aqueous veins. Br J Ophthalmol. 36 (5), 265-267 (1952).
- Hayreh, S. S., Scott, W. E. Fluorescein iris angiography. II. Disturbances in iris circulation following strabismus operation on the various recti. Arch Ophthalmol. 96 (8), 1390-1400 (1978).
- Virdi, P. S., Hayreh, S. S. Anterior segment ischemia after recession of various recti. An experimental study. Ophthalmology. 94 (10), 1258-1271 (1987).
- Bron, A. J., Easty, D. L. Fluorescein angiography of the globe and anterior segment. Trans Ophthalmol Soc U K. 90, 339-367 (1970).
- Ikegami, M. Fluorescein angiography of the anterior ocular segment. Part 1. Hemodynamics in the anterior ciliary vessels (author’s transl). Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 78 (7), 371-385 (1974).
- Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. J Cell Biol. 144 (4), 789-801 (1999).
- Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).
