Identification de MyoD Interactome Utilisation Tandem Affinity Purification couplée à la spectrométrie de masse
Summary
MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.
Abstract
différenciation terminale du muscle squelettique commence par l'engagement des cellules précurseurs mésodermiques pluripotentes à myoblastes. Ces cellules ont encore la capacité de proliférer ou ils peuvent se différencier et fusionnent en myotubes multinucléés, qui maturate encore pour former des myofibres. différenciation terminale du muscle squelettique est orchestré par l'action coordonnée des différents facteurs de transcription, en particulier les membres des facteurs ou des CTMR réglementaires musculaires (MyoD, Myogenin, Myf5 et MRF4), aussi appelé le bHLH myogéniques facteurs de transcription famille. Ces facteurs coopèrent avec des complexes de remodelage de la chromatine au sein complexe réseau de régulation transcriptionnelle pour atteindre myogenèse squelettique. En cela, MyoD est considéré comme le maître myogénique facteur de transcription dans le déclenchement de la différenciation terminale musculaire. Cette notion est renforcée par la possibilité de MyoD pour convertir les cellules non musculaires dans les cellules musculaires squelettiques. Nous décrivons ici une approche utilisée pour identifier MyoDpartenaires protéiques d'une manière exhaustive dans le but d'élucider les différents facteurs impliqués dans la différenciation terminale des muscles squelettiques. L'objectif à long terme est de comprendre les mécanismes épigénétiques impliqués dans la régulation des gènes du muscle squelettique, à savoir., Les cibles MyoD. Les partenaires MyoD sont identifiés à l'aide de purification d'affinité en tandem (TAP-Tag) à partir d'un système hétérologue couplée à la spectrométrie de masse (MS), la caractérisation, suivie de la validation du rôle des partenaires appropriés au cours de la différenciation terminale du muscle squelettique. des formes aberrantes de facteurs myogènes, ou leur régulation aberrante, sont associés à un certain nombre de troubles musculaires: myasthénie congénitale, la dystrophie myotonique, le rhabdomyosarcome et les défauts dans la régénération musculaire. En tant que tel, les facteurs myogéniques constituent un bassin de cibles thérapeutiques potentielles dans les troubles musculaires, à la fois en ce qui concerne les mécanismes qui causent la maladie elle-même et des mécanismes de régénération qui peut améliorer le traitement de la maladie. Ainsi, la understan détailléeding des interactions intermoléculaires et les programmes génétiques contrôlés par les facteurs myogéniques est essentiel pour la conception rationnelle de thérapies efficaces.
Introduction
organismes multicellulaires eucaryotes sont composés de différents organes et tissus. Chaque tissu fonctionnel présente un motif d'expression de gène spécifique qui est déterminé à chaque étape de la différenciation. la différenciation cellulaire implique l'activation de gènes spécifiques, l'entretien de leur expression et, en général, réduisant au silence d'un ensemble de gènes tels ceux impliqués dans la prolifération cellulaire. la différenciation des muscles squelettiques, ou la myogenèse est donc un procédé à plusieurs étapes, qui commence par la détermination des cellules souches mésodermiques en myoblastes, puis conduit à la différenciation terminale des myoblastes en premier mononuclées, puis multi nucléées, les myotubes . Ainsi, les myoblastes sont "déterminés" cellules, qui sont encore capables de proliférer, mais ils se sont engagés à la lignée du muscle squelettique, et peut donc se différencier uniquement dans les cellules musculaires squelettiques, soit au cours du développement embryonnaire ou chez les adultes la régénération musculaire. Le processus de terminal de muscle squelettique diffèrentciation est orchestrée par un programme génétique spécifique qui commence par la sortie définitive du cycle des cellules précurseurs de cellules de myoblastes qui conduit à une extinction définitive de la prolifération des gènes associés, tels que E2F gènes cibles 1. En effet, au cours du processus de différenciation terminale, myoblastes prolifération arrestation est une étape cruciale qui précède l'expression de gènes spécifiques du muscle squelettique et la fusion des myoblastes en myotubes 2. Un tel programme permet à des cellules souches musculaires adultes, également appelées cellules satellites, pour différencier au cours du processus de régénération suite à une lésion du muscle squelettique.
Myogenesis Mammalian dépend de manière critique sur une famille de l' hélice-boucle-hélice basique myogénique (bHLH) facteurs de transcription MyoD, Myf5, MRF4 et Myogenin, souvent appelé la famille de squelette facteurs de détermination musculaire ou MRF (Facteurs réglementaires musculaires) 3. Chacun d'eux joue un rôle essentiel dans la spécification et difrenciation des cellules musculaires squelettiques et a un motif d'expression spécifique 4 5-7. L'activation de MyoD et Myf5 constitue l'étape déterminante qui engage les cellules de la lignée myogénique, et l'expression subséquente de Myogenin déclenche myogenèse avec l'activation de gènes spécifiques du muscle squelettique, comme MCK (Muscle Creatine Kinase). Les facteurs de transcription bHLH myogéniques coopèrent avec les membres de la famille MEF2 dans l'activation des gènes musculaires de loci silencieux 8 précédemment. Elles stimulent également la transcription du gène du squelette musculaire hétérodimères avec des protéines bHLH omniprésentes, E12 et E47, appelées protéines qui se lient à E, que l' on appelle E-boîtes dans les différentes régions des gènes de régulation 8. Twist, Id (inhibiteur de la différenciation) et d' autres facteurs à réguler négativement ce processus, en compétition avec MyoD pour E protéines de liaison 8.
MyoD est considéré comme l'acteur majeur dans le déclenchement de la différenciation terminale musculaire 9 </sup> car il a la capacité d'induire une détermination myogénique / différenciation (trans-différenciation) programme dans de nombreux systèmes non-musculaires complètement différenciées 10-13. En effet, l' expression forcée de MyoD induit la trans-différenciation des différents types cellulaires , même ceux provenant d' une autre origine embryologique 12. Par exemple, MyoD peut convertir les hépatocytes, les fibroblastes, les mélanocytes, les neuroblastes et les adipocytes en cellules musculaires analogue. L'action trans-différenciation de MyoD implique une activation anormale du programme génétique myogénique (notamment ses gènes cibles) dans un environnement non-musculaire, concomitante à la réduction au silence du programme génétique d'origine (notamment, les gènes de prolifération).
Dans la prolifération des myoblastes, MyoD est exprimé , mais est incapable d'activer ses gènes cibles , même quand il se lie à leurs promoteurs 14-16. Par conséquent, l'exigence de MyoD soient exprimées en continu dans des myoblastes non différenciés reste assez elusive. MyoD pouvait réprimer ses gènes cibles en raison de recrutement d'enzymes de chromatine modifiant répressives dans la prolifération des myoblastes avant le chargement d'activer remodelage de la chromatine enzymes 14,17. Par exemple, dans la prolifération des myoblastes, MyoD est associée avec le co-répresseur de la transcription KAP-1, histone désacétylases (HDAC) et les méthyltransférases de la lysine répressive (Kmts), dont l'histone H3 lysine 9 ou H3K9 et H3K27 Kmts et suppriment activement l'expression des gènes cibles en établissant une structure chromatine localement répressive 14,17. Surtout, un rapport récent a indiqué que MyoD est lui – même directement méthylé par le H3K9 KMT G9a entraînant l'inhibition de son activité de transactivation 16.
Les mécanismes épigénétiques impliqués dans cette trans-différenciation des cellules non musculaires par MyoD sont largement inconnues. Notamment, certaines lignées cellulaires sont résistantes à l'induit MyoD-trans-différenciation. Ainsi, dans les cellules HeLa, MyoD est inactif oumême pourrait fonctionner comme répresseur plutôt que activateur de la transcription en raison du manque d'expression de la sous – unité BAF60C du remodelage de la chromatine complexe SWI / SNF 18. Ce modèle peut donc être de choix pour mieux caractériser les mécanismes de répression génique induite par MyoD. Il est également approprié pour tester la capacité de MyoD pour induire l' environnement de la chromatine répressive à sa loci cible avec ses partenaires associés et donc découvrir les mécanismes répressifs MyoD-dépendants dans la prolifération des myoblastes pour affiner la différenciation terminale.
Nous décrivons ici le protocole pour l'identification des partenaires MyoD en utilisant Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) couplée à la spectrométrie de masse (MS) la caractérisation. L'utilisation de cellules HeLa exprimant de manière stable S3 Flag-HA MyoD permis d'obtenir suffisamment de matériel pour purifier les complexes de MyoD à partir d'extraits nucléaires fractionnées. L'identification des partenaires de MyoD dans le système hétérologue a été suivie par validatidans un système pertinent.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode présentée permet une identification exhaustive des partenaires d'un facteur de transcription, MyoD. Elle a révélé des partenaires de MyoD dans un système hétérologue résistant à la différenciation induite MyoD, à savoir les cellules HeLa-S3. Ainsi, par définition, les partenaires de MyoD identifiés sont exprimés de façon ubiquitaire. Ceux – ci comprennent des facteurs généraux et spécifiques d' une séquence de transcription, des enzymes de modification de la chromatine, des proté…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in the Ait-Si-Ali lab was supported by the Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon); Institut National du Cancer (INCa); Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS; Université Paris Diderot and the ”Who Am I?” Laboratory of Excellence #ANR-11- LABX-0071 funded by the French Government through its ”Investments for the Future” program operated by the ANR under grant #ANR-11-IDEX-0005-01. EB was supported by an INCa grant.
Materials
| Cell lines | |||
| HeLa-S3 | ATCC | CCL-2.2 | |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Spinner | Corning | 778531 | |
| Homogenizer : Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1273 and 432-1271 | |
| Agitating device for spinners | Bellco | 778531 | |
| Sonicator | Diagenode | UCD 200 | |
| Hemocytometer | Marienfeld Superior | 640610 | |
| Low-binding tubes | Sorenson | 27210 | |
| Empty spin column | Bio-Rad | 7326204 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| SDS-polyacrylamide 4-12 % gel | Life technologies | NP0336BOX | |
| 4X loading buffer | Life technologies | NP0007 | |
| 10X reducing agent | Life technologies | NP0004 | |
| Silver staining kit | Life technologies | A8592 | |
| Centrifugal filter units, 10K | Millipore | UFC501024 | |
| Protein G agarose beads | Sigma-Aldrich | P4691 | |
| Protein A/G Resin | Thermo Scientific | 53132 | |
| Flag resin (anti-Flag M2-agarose affinity gel) | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| HA resin (monoclonal Anti-HA agarose) | Sigma-Aldrich | A2095 | |
| MNase | Sigma-Aldrich | N3755 | |
| Flag free peptide (DYKDDDDK) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/mL in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| HA free peptide (YPYDVPDYA) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/mL in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| Bicinchoninic acid based protein assay kit : BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protease inhibitors | Sigma-Aldrich | S8830 | |
| Luminol-based enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate | Life technologies | 34075 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Sheared salmon sperm DNA (Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Spermine tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | S1141 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| MOPS running buffer | Life technologies | NP0001 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma-Aldrich | D0822 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Trypsin-EDTA (0.05% phenol red | Life technologies | 25300-054 | |
| Serum | GE healthcare life sciences | PAA A15-102 | Each lot of serum has to be first tested for your cells. |
| Penicillin and Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 | |
| Water (sterile-filtered) | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| HA from rat (12CA5) | Roche | 11583816001 | |
| Flag | Sigma-Aldrich | A8592 | |
| MyoD | Santa Cruz | sc-32758 | To use for western blotting |
| MyoD | Santa Cruz | SC-760 | To use for immunoprecipitation and western blotting |
| CBFbeta | Santa Cruz | FL-182 | |
| HP1alpha | Euromedex | 2HP2G9 | |
| HP1beta | Euromedex | 1MOD1A9AS | |
| HP1gamma | Euromedex | 2MOD1GC | |
| Suv39h1 | Cell Signaling Technology | 8729 | |
| BAF47 | BD Biosciences | 612111 | |
| Myf5 | Santa Cruz | SC-302 | |
| Tubulin | Sigma-Aldrich | T9026 | |
| Actin | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| IgG Mouse | Santa Cruz | SC-2025 | |
| IgG Rabbit | Santa Cruz | SC-2027 | |
| Goat anti-rat -HRP | Sigma-Aldrich | A9037 | |
| Goat anti-rabbit -HRP | Sigma-Aldrich | A6154 | |
| Goat anti-mouse -HRP | Sigma-Aldrich | A4416 |
Riferimenti
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