Ориентация биопленки Associated<em> Стафилококк</em> Использование ресазурин На основе лекарственной чувствительности анализа
Summary
Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.
Abstract
Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.
Introduction
Патогенные микроорганизмы могут образовывать биопленки в естественных условиях , приводящих к неострыми хронических инфекций 1. Биопленки-ассоциированной инфекции является серьезным фактором риска медицинских процедур, связанных с вживление инородных предметов (например, искусственные замены костей, грудные имплантаты) или установку трахеи трубок или мочевые катетеры 2. В этом контексте, антиинфекционной терапии почти всегда необходимо , так как биопленка на основе инфекции редко очищается самостоятельно, даже у иммунокомпетентных лиц. Золотистый стафилококк является одним из наиболее часто встречающихся патогенов , причастным биопленки осложнений , связанных , возникающих в процессе использования инвазивные медицинские устройства 3.
К сожалению, сама природа биопленок как защитный барьер делает их более устойчивыми к лечению , чем планктонных клеток 1,4, и оценка прогнозируемой клинической эффективности является важной частью как начальнаяразработки лекарственных средств, а также надзор за лекарственной устойчивостью. Существует все больше признание того, что лабораторные условия, ориентированные на планктонных культур, не может точно представлять реальную болезнь 5. Еще более усугубляет проблему, репликация биопленки фенотипов трудно, и существующие модели биопленки являются утомительным и страдают от высокой меж- и изменчивости внутри анализа 6. Таким образом, многие исследователи, по необходимости, по умолчанию планктонных клеток анализов лекарственной чувствительности, тем самым потенциально пренебрегая важный аспект бактериальной вирулентности и болезни.
Здесь мы опишем протокол для опробования бактерий, в частности S. стафилококк, в предварительно выращенных биопленок с использованием 96-луночного системы на основе биопленки 7,8. Хотя протокол для образования биопленки и вызов следует по существу рекомендации производителя, мы представляем альтернативную информацию богатой методологии для количественной оценки жизнеспособности biofILM после заражения. Вкратце, бактерии культивировали в колок пластине, где биопленки образуют на выступающими штифтами, прикрепленных к крышке пластины. После образования биопленки, колышки осторожно опускают в лунки свежей пластинки, заполненной PBS, чтобы удалить планктонные клетки. Колышек крышкой, с биопленок прикрепленными, переносится на новый вызов пластины, содержащей различные концентрации антибиотиков, которые будут проанализированы. После второй инкубации крышки снова удаляют, промывают, и переносили на пластину, содержащую восстановления резазурин краситель, где они подвергаются окончательному инкубацию. преобразование ресазурин могут быть записаны кинетически или взяты в качестве конечной точки чтения после определенного периода восстановления. Этот метод на основе красителя количественной оценки жизнеспособности биопленки значительно отличается от утомительных (образующих единиц колонии) КОЕ методологии рассчитывать на основе описанной в первоначальном протоколе 7. OD 600 измерения провокационной наркотиков пластины и резазурин кинетики превращения служат жизнеспособности чтениявыходы планктонных и биопленки клеток, соответственно, предлагая быстрый, надежный, богатый информацией и технически простой анализ для выживания биопленки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описали модифицированный анализ биопленки для определения активности тестируемых ингибиторов на S. стафилококк биопленки сосредоточив внимание на метаболического состояния биопленки ассоциированных клеток. В то время как рекомендации в основном имитировали производи…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Saran Kupul for technical assistance. This work was supported in part by NIH grant R01-AI104952 to FW. Further support was provided by the University of Alabama at Birmingham (UAB) Center for AIDS Research (CFAR), an NIH funded program (P30 AI027767) that was made possible by the following NIH Institutes: NIAID, NIMH, NIDA, NICHD, NHLDI, NIA.
Materials
| Mueller-Hinton Medium | Oxoid | CM0405 | Follow recommendations of manufacturer |
| RPMI-medium | Corning | 17-105-CV | |
| CRPMI | Ref 9 | RPMI-1640 medium chelexed for 1h with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640 | |
| Chelex 100 Resin | Bio Rad | 142-2822 | |
| MBEC-plates | Innovotech | 19111 | |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | 800µg/ml in DI water Filter sterile |
| Micro Plate Shaking Platform | Heidolph Titramax 1000 | ||
| Cytation 3 Plate Reader | Biotek | ||
| Gen5 software | Biotek | Recording and analysis of resazurin conversion | |
| Neocuproine | Sigma | N1501 | prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80ºC |
| Copper sulfate | Acros Organics | 7758-99-8 | prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4ºC |
| Cu-Neocuproine | Self-Made | Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration. | |
| Gentamicin | Sigma | G3632-1G |
Riferimenti
- Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M., Hoiby, N. Applying insights from biofilm biology to drug development – can a new approach be developed. Nat Rev Drug Discov. 12, 791-808 (2013).
- Song, Z., et al. Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms. Orthop Rev (Pavia). 5, 65-71 (2013).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases). Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).
- Bordi, C., de Bentzmann, S. Hacking into bacterial biofilms: a new therapeutic challenge. Ann Intensive Care. 1, 19 (2011).
- Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror ‘real-world’ pathogenesis?. Trends Microbiol. 13, 58-63 (2005).
- Kwasny, S. M., Opperman, T. J. Static biofilm cultures of Gram-positive pathogens grown in a microtiter format used for anti-biofilm drug discovery. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 13, Unit 13A 18 (2010).
- Ceri, H., et al. The MBEC Assay System: multiple equivalent biofilms for antibiotic and biocide susceptibility testing. Methods Enzymol. 337, 377-385 (2001).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J Clinical Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Baker, J., et al. Copper stress induces a global stress response in Staphylococcus aureus and represses sae and agr expression and biofilm formation. Appl Environ Microbiol. 76, 150-160 (2010).
- Haeili, M., et al. Copper complexation screen reveals compounds with potent antibiotic properties against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 3727-3736 (2014).
- O’Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. Eur J Biochem. 267, 5421-5426 (2000).
- Mah, T. F. Establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (MBC-P) and biofilm cells (MBC-B). J Vis Exp. (83), e50854 (2014).
- Junker, L. M., Clardy, J. High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).
- Shah, D., et al. Persisters: a distinct physiological state of E. coli. BMC Microbiol. 6, 53 (2006).
- Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45, 999-1007 (2001).
