Gericht op biofilm geassocieerde<em> Staphylococcus aureus</em> Met behulp van Resazurin Gebaseerd Drug-gevoeligheid Assay

Summary

Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.

Abstract

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.

Introduction

Pathogene bacteriën kunnen biofilms in vivo leidt tot niet-acute chronische infecties ¹ vormen. Biofilm geassocieerde infectie is een ernstige risicofactor van medische procedures die de implantatie van vreemde voorwerpen (bijvoorbeeld kunstbot vervangingen, borstimplantaten) of de installatie van tracheale buizen of urine-katheters ² te betrekken. In deze context, anti-infectieuze therapie is vrijwel altijd nodig als biofilm-gebaseerde infecties zelden gewist als zodanig, zelfs bij immuuncompetente individuen. Staphylococcus aureus is een van de meest voorkomende pathogenen betrokken in biofilm-gerelateerde complicaties optreden gedurende het gebruik van invasieve medische hulpmiddelen ^3.

Helaas, de aard van biofilms als een beschermende barrière maakt ze beter bestand zijn tegen de behandeling dan plankton cellen ^1,4, en de evaluatie van de voorspelde klinische werkzaamheid is een cruciaal onderdeel van zowel de initiëlegeneesmiddelontwikkeling en resistentie surveillance. Er is steeds meer erkenning dat laboratoriumomstandigheden, gericht op planktonische culturen, mag niet getrouw vertegenwoordigen real-world ziekte ^5. Verdere compounding het probleem, replicatie van biofilm fenotypes is moeilijk, en de bestaande biofilm modellen zijn vervelend en lijden aan hoge inter- en intra-assay variabiliteit ^6. Zo veel onderzoekers, noodgedwongen uit standaard planktonische celbepalingen drug gevoeligheid, waardoor mogelijk dat daarbij een belangrijk aspect van bacteriële virulentie en ziekte.

Hier beschrijven we het protocol voor het testen van bacteriën, in het bijzonder S. aureus, in pre-biofilms gegroeid onder toepassing van een 96 putjes gebaseerde biofilmsysteem ^7,8. Terwijl het protocol voor de vorming en uitdaging biofilm volgt in wezen de aanbeveling van de fabrikant, presenteren we een alternatieve informatie-rijke methodologie voor het kwantificeren van de levensvatbaarheid van de BIOFilm na challenge. Kort bacteriën worden gekweekt in de penplaat, waarbij biofilms gevormd op de uitstekende pennen bevestigd aan het deksel van de plaat. Na de vorming van biofilm, worden de haringen zachtjes gedoopt in putjes van een nieuwe plaat gevuld met PBS om plankton cellen te verwijderen. De peg-deksel, met biofilms bevestigd, wordt overgebracht naar een nieuwe uitdaging plaat gemaakt met verschillende concentraties antibiotica te testen. Na een tweede incubatie worden deksels weer verwijderd, gewassen en overgebracht naar een plaat die herstel Resazurin kleurstof, waar een laatste incubatie. Resazurin conversie kan kinetisch worden opgenomen of genomen als een eindpunt lezen na een bepaalde herstelperiode. Deze dye-gebaseerde methode voor het kwantificeren van de levensvatbaarheid van biofilms verschilt aanzienlijk van de vervelende CFU (kolonievormende eenheden) count-gebaseerde methode in het oorspronkelijke protocol ⁷ beschreven. OD ₆₀₀ metingen van de drug uitdaging bord en resazurin conversie kinetiek dienen als levensvatbaarheid gelezenouts van planktonische en biofilm cellen, respectievelijk, het aanbieden van een snelle, betrouwbare, informatie-rijke en technisch eenvoudige test voor biofilm te overleven.

Protocol

1. Biofilm Initiatie Grow een cultuur van biofilm produceren organisme in een voedselrijke medium. Inoculeer Staphylococcus aureus stam Newman in 10 ml Mueller-Hinton medium uit een glycerol voorraad. Voer alle werkzaamheden waarbij het ​​hanteren van S. aureus met handschoenen en binnen een bioveiligheid kast. Incubeer gedurende 16 uur bij 37 ° C op een roterende schudinrichting (100-200 rpm). Bepaal de OD 600 van de cultuur met behulp van een spectrofoto…

Representative Results

De resazurin test is gevoelig genoeg om zeer weinig levensvatbare cellen kan repliceren in drug vrij medium na challenge betrouwbaar detecteren. In deze methode, definiëren we de minimale biofilm uitroeiing concentratie als de laagste concentratie waarbij geen resazurin conversie waargenomen binnen 24 uur. De resazurin assay berust op oxidatieve moleculen gevonden in metabolisch actieve cellen die de kleurstof kleur omzetten van blauw naar roze. Kleurstof conversie is dus een indicatie …

Discussion

Hier beschrijven we een gemodificeerde biofilm gekwantificeerd door activiteit van geteste remmers op S. aureus biofilms gericht op de metabole toestand van biofilm geassocieerde cellen. Terwijl de beschreven biofilm initiatie en beroepsprocedures veelal nagebootste aanbevelingen van de fabrikant, het gebruik van Resazurin kleurstof-biofilm geassocieerde cellen die een 24-uurs-remmer uitdaging overleven detecteren en te kwantificeren vereenvoudigt volgens de methode van de cel herstel (via waterbad sonificatie)…

Materials

Mueller-Hinton Medium	Oxoid	CM0405	Follow recommendations of manufacturer
RPMI-medium	Corning	17-105-CV
CRPMI	Ref 9		RPMI-1640 medium chelexed for 1h with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640
Chelex 100 Resin	Bio Rad	142-2822
MBEC-plates	Innovotech	19111
Resazurin Sodium Salt	Sigma	R7017	800µg/ml in DI water     Filter sterile
Micro Plate Shaking Platform	Heidolph Titramax 1000
Cytation 3 Plate Reader	Biotek
Gen5 software	Biotek		Recording and analysis of resazurin conversion
Neocuproine	Sigma	N1501	prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80ºC
Copper sulfate	Acros Organics	7758-99-8	prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4ºC
Cu-Neocuproine	Self-Made		Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration.
Gentamicin	Sigma	G3632-1G