バイオフィルム関連をターゲット<em>黄色ブドウ球菌</em>レサズリン基づく薬剤感受性アッセイを使用して
Summary
Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.
Abstract
Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.
Introduction
病原性微生物は、非急性慢性感染1に導くインビボでバイオフィルムを形成することができます。バイオフィルム関連感染は、異物（ 例えば、人工骨置換、乳房インプラント）、または気管チューブまたは尿道カテーテル2のインストールの注入を伴う医療処置の重大な危険因子です。バイオフィルムベースの感染はめったに自分でクリアされないように、これらの状況では、抗感染療法も免疫応答性個体では、ほとんど常に必要である。 黄色ブドウ球菌は、の使用中に発生するバイオフィルム関連の合併症に関与し、最も頻繁に観察された病原体の一つであります侵襲性医療機器3。
残念ながら、保護バリアとしてのバイオフィルムの本質は、浮遊細胞1,4より治療に対してより耐性になり、予測臨床的有効性の評価は、両方の初期の重要な部分です医薬品開発だけでなく、薬剤耐性サーベイランス。プランクトンの文化に焦点を当てた実験室条件は、忠実に実世界の疾病5を表していない可能性があること増加肯定応答があります。さらに問題を配合、バイオフィルムの表現型の複製は困難であり、既存のバイオフィルムモデルは面倒であり、高間およびアッセイ内変動6苦しみます。このように、多くの研究者は、必要を通じて、それによって潜在的に細菌毒性および疾患の重要な側面を無視し、薬剤感受性の浮遊性細胞アッセイをデフォルトに。
ここでは、具体的には、S、細菌をアッセイするためのプロトコルを記述します96ウェルベースのバイオフィルムシステム7,8を利用して事前に成長したバイオフィルム中の黄色ブドウ球菌 、。バイオフィルム形成と挑戦のためのプロトコルは、本質的に製造業者の勧告に従っているが、我々はbioF遺伝子の生存率を定量化するための代替情報が豊富な方法論を提示しますチャレンジ後ILM。簡単に説明すると、細菌がバイオフィルムは、プレートの蓋に取り付けられた突出ペグに形成ペグプレートで培養されます。バイオフィルム形成後、ペグは穏やかに浮遊細胞を除去するためにPBSで満たされた新鮮なプレートのウェル中に浸漬されています。ペグ蓋は、添付のバイオフィルムで、アッセイされる抗生物質の種々の濃度を含む、新規のチャレンジプレートに移します。第二のインキュベーションの後、蓋を再び取り出し、洗浄し、そしてそれらが最終インキュベーションを受けるレサズリン色素を含有する回収プレートに移します。レサズリン変換を動力学的に記録された、または定義された回復期間の後、エンドポイントの読み取りとすることができます。独自プロトコル7に記載され、このバイオフィルムの生存率を定量化するの染料ベースの方法は退屈CFU（コロニー形成単位）かなり異なるカウントベースの方法論。 OD薬物挑戦板とレサズリン変換速度の600の測定値は、生存率のリードとして働きますそれぞれプランクトンとバイオフィルム細胞のアウト、バイオフィルムの生存のための高速で信頼性の高い、情報が豊富で技術的に簡単な分析を提供しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、Sでテストした阻害剤の活性を測定するために修飾バイオフィルムアッセイを記載していますバイオフィルム関連する細胞の代謝状態に焦点を当て球菌バイオフィルム。記載のバイオフィルムの開始とチャレンジ手順主に模倣メーカーの推奨事項が、24時間の阻害剤の挑戦を生き残るバイオフィルム関連細胞を検出し、定量化するための色素をレサズリンの使用は劇的?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Saran Kupul for technical assistance. This work was supported in part by NIH grant R01-AI104952 to FW. Further support was provided by the University of Alabama at Birmingham (UAB) Center for AIDS Research (CFAR), an NIH funded program (P30 AI027767) that was made possible by the following NIH Institutes: NIAID, NIMH, NIDA, NICHD, NHLDI, NIA.
Materials
| Mueller-Hinton Medium | Oxoid | CM0405 | Follow recommendations of manufacturer |
| RPMI-medium | Corning | 17-105-CV | |
| CRPMI | Ref 9 | RPMI-1640 medium chelexed for 1h with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640 | |
| Chelex 100 Resin | Bio Rad | 142-2822 | |
| MBEC-plates | Innovotech | 19111 | |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | 800µg/ml in DI water Filter sterile |
| Micro Plate Shaking Platform | Heidolph Titramax 1000 | ||
| Cytation 3 Plate Reader | Biotek | ||
| Gen5 software | Biotek | Recording and analysis of resazurin conversion | |
| Neocuproine | Sigma | N1501 | prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80ºC |
| Copper sulfate | Acros Organics | 7758-99-8 | prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4ºC |
| Cu-Neocuproine | Self-Made | Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration. | |
| Gentamicin | Sigma | G3632-1G |
Riferimenti
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