التصور الأوعية الدموية ومتني التجديد بعد استئصال الكبد الجزئي 70٪ في الفئران العادية
Summary
Tools used for visualizing vascular regeneration require methods for contrasting the vascular trees. This film demonstrated a delicate injection technique used to achieve optimal contrasting of the vascular trees and illustrate the potential benefits resulting from a detailed analysis of the resulting specimen using µCT and histological serial sections.
Abstract
تم استخدام الإجراء حقن السيليكون تعديل لرؤية الشجرة الوعائية الكبدية. هذا الإجراء يتكون من حقن في الجسم الحي من مجمع سيليكون، عبر 26 G القسطرة، في المدخل أو الوريد الكبدي. بعد حقن السيليكون، وexplanted الأجهزة وأعد ل-CT الدقيقة (μCT) مسح السابقين فيفو. الإجراء حقن السيليكون يمثل تحديا تقنيا. تحقيق نتيجة ناجحة يتطلب خبرة المجهرية واسعة من الجراح. واحدة من التحديات التي تواجه هذا الإجراء ينطوي على تحديد سعر نضح الكافي لمركب السيليكون. معدل نضح لمركب السيليكون يحتاج إلى تعريف يستند إلى الدورة الدموية للنظام الأوعية الدموية في المصالح. معدل نضح غير لائق يمكن أن يؤدي إلى نضح غير مكتمل، تمدد الاصطناعي وتمزق الأشجار الأوعية الدموية.
واستند إعادة الإعمار 3D للنظام الأوعية الدموية في الأشعة المقطعية وتحقيقه باستخدامبرنامج ما قبل السريرية مثل HepaVision. نوعية الشجرة الوعائية التي أعيد بناؤها له علاقة مباشرة بنوعية نضح السيليكون. حسبت المعلمات الأوعية الدموية حسابها لاحقا إرشادية للنمو الأوعية الدموية، مثل إجمالي حجم الأوعية الدموية، استنادا إلى إعادة ترميم الأوعية الدموية. المتناقضة الشجرة الوعائية مع سيليكون يسمح لاحق النسيجي متابعة العمل من العينة بعد μCT المسح. العينة يمكن أن تخضع لباجتزاء المسلسل، والتحليل النسيجي وكله مسح الشرائح، وبعد ذلك لإعادة الإعمار 3D من الأشجار الأوعية الدموية على أساس الصور النسيجية. هذا هو الشرط الأساسي للكشف عن الأحداث الجزيئية وتوزيعها فيما يتعلق الشجرة الوعائية. ويمكن أيضا أن هذا الإجراء حقن السيليكون تعديل استخدامها لتصور وإعادة بناء أنظمة الأوعية الدموية من الأجهزة الأخرى. هذه التقنية لديها القدرة على أن تطبق على نطاق واسع في الدراسات المتعلقة تشريح الأوعية الدموية والنمو في مختلف حيوانالثاني نماذج المرض.
Introduction
وغالبا ما يحدد الكبد تجديد عن طريق قياس زيادة الوزن الكبد والحجم، من خلال تقييم معدل انتشار الكبدية 16. ومع ذلك، وتجديد الكبد تحملها ليس فقط تجديد متني ولكن أيضا تجديد الأوعية الدموية 6. ولذلك، ينبغي مواصلة التحقيق في نمو الأوعية الدموية فيما يتعلق بدورها في تطور تجديد الكبد. تصور من الأوعية الدموية الكبدية أمر بالغ الأهمية لتعزيز فهمنا لتجديد الأوعية الدموية. وقد وضعت وسائل غير مباشرة عديدة لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء تجديد الأوعية الدموية الكبدية. تقليديا، والكشف عن السيتوكينات (عامل النمو البطاني الوعائي، VEGF) 14، كانت كيموكينات ومستقبلاتها (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12) 4 الدعامة الأساسية لدراسة تجديد الأوعية الدموية. ومع ذلك، فإن نموذج 3D جنبا إلى جنب مع التحليل الكمي من الأوعية الدموية إضافة التشريحية الحرجةالمعلومات للحصول على فهم أفضل للعلاقة هامة بين متني كبدي وتجديد الأوعية الدموية.
لتصور الأوعية الدموية الكبدية، الأمر الذي يتطلب المتناقضة الأشجار الأوعية الدموية، تم حقن الفئران مع وكيل النقيض من مطاط السيليكون ظليل للأشعة مباشرة إلى البوابة أو الكبد شجرة الأوعية الدموية الوريدية. بعد البلمرة من السيليكون وexplantation من الجهاز، تعرض عينات الكبد لμCT المسح الضوئي باستخدام ماسح التصوير المقطعي. وأسفرت عمليات المسح في تمثيل صورة فوكسل من السيليكون حقن عينات 9.
لمراقبة الجودة، وتصور نظام الأوعية الدموية لأول مرة في 3D باستخدام برنامج ما قبل السريرية. تم تنفيذ التقسيم من خلال تحديد عتبة بين كثافة الأنسجة اللينة وكثافة السفينة. وقد تصور قناع سفينة الناتجة باستخدام جعل السطح. يسمح البرنامج أيضا لتحديد اليدوي للمعلمتين من vasculنمو AR: طول السفينة القصوى ونصف قطرها.
ثم استخدام برنامج ما قبل السريرية لإعادة الإعمار 3D من الأشجار الأوعية الدموية وحساب لاحق من توريد أو تجفيف الأراضي الوعائية 13. وبالإضافة إلى ذلك، وهذا البرنامج تحدد تلقائيا المعلمات معينة من نمو الأوعية الدموية، مثل الطول الإجمالي لجميع الهياكل الأوعية الدموية مرئية المعروف أيضا باسم مجموع طول حافة أو إجمالي حجم السفينة.
تم تنفيذ الإجراء سيليكون نضح في الفئران ساذجة وفي الفئران التي خضعت 70٪ استئصال الكبد الجزئي (PH). تم جمع كبد في مختلف نقاط وقت الملاحظة بعد الاستئصال الجزئي لتحليل الأوعية الدموية ومتني تجديد الكبد باستخدام التصور وتقدير التقنية المذكورة آنفا.
الأهداف الرئيسية لهذا الفيلم هي: (1) إظهار الحساسة حقن التقنية اللازمة لتحقيق المتناقضة الأمثل و(2) عرض محتمل الاب الفوائد الناتجة عن ذلكام تحليلا مفصلا للعينة الناتجة باستخدام μCT وأقسام مسلسل النسيجية. بعد مشاهدة هذا الفيلم، يجب أن يكون القارئ على فهم أفضل لكيفية حقن مركب السيليكون في نظام الأوعية الدموية محددة وللفائدة وتطبيق هذه التقنية.
Protocol
Representative Results
Discussion
المتناقضة الشجرة الوعائية عن طريق الحقن سيليكون وμCT المسح تم تقديمها في نماذج ورم ونماذج الأمراض العصبية في كثير من الأحيان لدراسة تطور عائية 5،7،8،10. تم إجراء تحسينات في منهجية حقن السيليكون في هذه الدراسة لتصور وقياس نمو الأوعية الدموية بعد استئصال الكبد الج?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding by the German Ministry of Education and Research (BMBF) via the systems biology network “Virtual Liver”, grant numbers 0315743 (ExMI), 0315765 (UK Jena), 0315769 (MEVIS).The authors also thank Frank Schubert for technical support.
Materials
| PERFUSOR® VI | B.BRAUN | 87 222/0 | |
| Pipetus®-akku | Hirschmann | 9907200 | |
| Pipets | Greiner | 606180 | |
| micro scissors | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 14058-09 | |
| micro serrefine | Fine Science Tools (F·S·L) | No.18055-05 | |
| Micro clamps applicator | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 18057-14 | |
| Straight micro forceps | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 00632-11 | |
| Curved micro forceps | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 00649-11 | |
| needle-holder | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 12061-01 | |
| 1ml syringe | B.Braun | 9161406V | |
| 5ml syringe | B.Braun | 4606051V | |
| extension and connection lines | B.Braun | 4256000 | 30cm, inner ø1.2mm |
| 6-0 silk (Perma-Hand Seide) | Ethicon | 639H | |
| 6-0 prolene | Ethicon | 8711H | |
| Microfil® MV diluent | FLOW TECH, INC | ||
| Microfil® MV – 120 | FLOW TECH, INC | MV – 120 (blue) | |
| MV curing agent | FLOW TECH, INC | ||
| Heparin 2500 I.E./5ml | Rotexmedica | ETI3L318-15 | |
| Saline | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | E15117/D DE | |
| Imalytics Preclinical software | Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, Germany | ||
| HepaVision | Fraunhofer MEVIS, Bremen, Germany | ||
| NanoZoomer 2.0-HT Digital slide scanner | Hamamatsu Electronic Press, Japan | C9600 | |
| Tomoscope Duo CT | CT Imaging GmbH, Erlangen, Germany | TomoScope® Synergy | |
References
- Bearden, S. E., Segal, S. S. Neurovascular alignment in adult mouse skeletal muscles. Microcirculation. 12 (2), 161-167 (2005).
- Brown, R. P., Delp, M. D., Lindstedt, S. L., Rhomberg, L. R., Beliles, R. P. Physiological parameter values for physiologically based pharmacokinetic models. Toxicol.Ind.Health. 13 (4), 407-484 (1997).
- Dai, D., et al. Elastase-Induced Intracranial Dolichoectasia Model in Mice. Neurosurgery. , (2015).
- Ding, B. S., et al. Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration. Nature. 468 (7321), 310-315 (2010).
- Downey, C. M., et al. Quantitative ex-vivo micro-computed tomographic imaging of blood vessels and necrotic regions within tumors. PLoS.One. 7 (7), 41685 (2012).
- Ehling, J., et al. CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis. Gut. , (2014).
- Ehling, J., et al. Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization. Am.J.Pathol. 184 (2), 431-441 (2014).
- Ghanavati, S., Yu, L. X., Lerch, J. P., Sled, J. G. A perfusion procedure for imaging of the mouse cerebral vasculature by X-ray micro-CT. J.Neurosci.Methods. 221, 70-77 (2014).
- Gremse, F., et al. Hybrid microCT-FMT imaging and image analysis. J.Vis.Exp. (100), (2015).
- Jing, X. L., et al. Radiomorphometric quantitative analysis of vasculature utilizing micro-computed tomography and vessel perfusion in the murine mandible. Craniomaxillofac.Trauma Reconstr. 5 (4), 223-230 (2012).
- Melloul, E., et al. Small animal magnetic resonance imaging: an efficient tool to assess liver volume and intrahepatic vascular anatomy. J.Surg.Res. 187 (2), 458-465 (2014).
- Schwier, M., Bohler, T., Hahn, H. K., Dahmen, U., Dirsch, O. Registration of histological whole slide images guided by vessel structures. J.Pathol.Inform. 4 ((Suppl)), 10 (2013).
- Selle, D., Preim, B., Schenk, A., Peitgen, H. O. Analysis of vasculature for liver surgical planning. IEEE Trans.Med.Imaging. 21 (11), 1344-1357 (2002).
- Shergill, U., et al. Inhibition of of VEGF- and NO-dependent angiogenesis does not impair liver regeneration. Am.J.Physiol Regul.Integr.Comp Physiol. 298 (5), 1279-1287 (2010).
- Sueyoshi, R., Ralls, M. W., Teitelbaum, D. H. Glucagon-like peptide 2 increases efficacy of distraction enterogenesis. J.Surg.Res. 184 (1), 365-373 (2013).
- Wei, W., et al. Rodent models and imaging techniques to study liver regeneration. Eur.Surg.Res. 54 (3-4), 97-113 (2015).
- Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. J.Vis.Exp. (92), e51955 (2014).
