Visualisierung von Gefäß- und Parenchymregeneration nach 70% Teilhepatektomie in normalen Mäusen
Summary
Tools used for visualizing vascular regeneration require methods for contrasting the vascular trees. This film demonstrated a delicate injection technique used to achieve optimal contrasting of the vascular trees and illustrate the potential benefits resulting from a detailed analysis of the resulting specimen using µCT and histological serial sections.
Abstract
Eine modifizierte Silikoninjektionsverfahren wurde zur Sichtbarmachung des Leber-Gefäßbaum verwendet. Dieses Verfahren bestand aus in-vivo – Injektion der Siliconverbindung, über eine 26 G – Katheter, in das Portal oder Lebervene. Nach Silikon Injektion wurden Organe explantiert und für die Ex-vivo – Mikro-CT (μCT) Scannen vorbereitet. Die Silikon-Injektionsverfahren ist technisch anspruchsvoll. ein erfolgreiches Ergebnis zu erreichen, erfordert umfangreiche mikro Erfahrung des Chirurgen. Eine der Herausforderungen dieses Verfahren beinhaltet die Bestimmung der angemessenen Perfusionsgeschwindigkeit für die Siliconverbindung. Die Perfusionsgeschwindigkeit für die Silicon-Verbindung muss auf der Basis der hämodynamischen des Gefäßsystems von Interesse definiert werden. Unangemessen Perfusionsrate kann zu einer unvollständigen Perfusion, künstliche Dilatation und Ruptur von Gefäßbäumen führen.
Die 3D-Rekonstruktion des Gefäßsystems wurde auf CT-Scans basieren und wurde erreicht unter Verwendung vonpräklinische Software wie HepaVision. Die Qualität des rekonstruierten Gefäßbaum wurde direkt auf die Qualität des Silicon-Perfusions verwandt. Anschließend berechnet Gefäßparameter indikativ für Gefäßwachstum, wie Gesamtgefäßvolumen, wurden basierend auf den vaskulären Rekonstruktion berechnet. Kontras den Gefäßbaum mit Silikon für die anschließende histologische Aufarbeitung der Probe nach μCT Scannen erlaubt. Die Probe kann auf Serienschnitt, histologische Analyse und ganze Dia Scan unterzogen werden, und danach auf 3D-Rekonstruktion der Gefäßbäume basierend auf histologischen Bildern. Dies ist die Voraussetzung für die Erkennung von molekularen Ereignissen und deren Verteilung in Bezug auf den Gefäßbaum. Dieses modifizierte Silikoninjektionsverfahren können auch die Gefäßsysteme anderer Organe zu visualisieren und zu rekonstruieren, verwendet werden. Diese Technik hat das Potenzial, umfassend Studien angewendet werden Gefäßanatomie über und Wachstum in verschiedenen Tier and Krankheitsmodelle.
Introduction
Leberregeneration wird durch Messen der Zunahme des Lebergewichts und Volumens und durch die Bewertung der Hepatozyten Proliferationsrate 16 häufig bestimmt. Allerdings ist die Regeneration der Leber nicht nur Parenchymregeneration induziert , sondern auch Gefäßregeneration 6. Daher sollte Gefäßwachstum weiter in Bezug auf ihre Rolle bei der Progression der Leberregeneration untersucht werden. Visualisierung des Lebergefäßsystems ist von entscheidender Bedeutung für unser Verständnis der vaskulären Regeneration voranzutreiben. Zahlreiche indirekte Methoden wurden die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Lebergefäßregeneration zu studieren entwickelt. Traditionell Nachweis von Zytokinen (vascular endothelial growth factor, VEGF) 14, Chemokine und deren Rezeptoren (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12) 4 haben die tragende Säule gewesen vaskuläre Regeneration für das Studium. Jedoch zusammen ein 3D-Modell mit quantitativen Analyse des Gefäßsystems würde hinzufügen kritischen anatomischenInformationen ein besseres Verständnis für die wichtige Beziehung zwischen Leberparenchyms und Gefäßregeneration zu gewinnen.
Um die hepatische Gefäßsystem sichtbar zu machen, die die vaskuläre Bäume erfordert kontras wurden Mäuse mit einem strahlenundurchlässigen Silikonkautschuk Kontrastmittel direkt in das Portal oder hepatische venöse Gefäßbaum injiziert. Nach der Polymerisation des Silikon und Explantation des Organs, wurden die Leberproben zu μCT Abtastung unterworfen, um ein CT-Scanner. Die Scans ergaben in Voxel-Bilddarstellungen des silikonInjektionsProben 9.
Für die Qualitätskontrolle wurde das Gefäßsystem zunächst in 3D mit präklinischen Software visualisiert. Die Segmentierung erfolgt durch Setzen einer Schwelle zwischen dem weichen Gewebe Intensität und der Gefäß Intensität durchgeführt. Die sich ergebende Gefäß Maske wurde unter Verwendung von Oberflächendarstellung visualisiert. Die Software auch für die manuelle Bestimmung von zwei Parametern von vascul erlaubtar Wachstum: maximale Schiffslänge und Radius.
Eine präklinische Software wurde dann zur 3D – Rekonstruktion von Gefäßbäumen und die anschließende Berechnung der Lieferung oder Trockenlegung Gefäßterritorien 13 verwendet. Darüber hinaus bestimmt dieses Software automatisch bestimmte Parameter der Gefäßwachstum, wie beispielsweise die Gesamtlänge aller sichtbaren Gefäßstrukturen auch als die Gesamtkantenlänge oder Gesamtbehältervolumen bekannt.
Die Silikon-Perfusions-Verfahren wurde in naiven Mäusen und in Mäusen durchgeführt, die 70% partielle Hepatektomie (PH) unterzog. Die Lebern wurden zur Analyse von Gefäß- und parenchymalen Leberregeneration bei unterschiedlichen Beobachtungszeitpunkten nach der Resektion gesammelt, um die oben genannten Visualisierung und Quantifizierung Technik.
Die Hauptziele dieses Films sind: (1) erforderlich, um die empfindlichen Spritztechnik zeigen eine optimale Kontrastierung zu erreichen, und (2) zeigen den möglichen Nutzen daraus resultierende from eine detaillierte Analyse der erhaltenen Probe μCT und histologischen Schnittserien mit. Nachdem sie diesen Film sehen, sollte der Leser ein besseres Verständnis dafür, wie Silicon-Verbindung in einem bestimmten Gefäßsystem und von der Nützlichkeit und Anwendbarkeit der Technik zu injizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kontras den Gefäßbaum durch Silikon – Injektion und μCT – Scanning wurde 5,7,8,10 die angiogene Progression häufig zu studieren in Tumormodellen und neurologische Krankheitsmodelle eingeführt. Verbesserungen in der Methodik der Silikoninjektion wurden in der vorliegenden Studie zur Visualisierung und Quantifizierung von vaskulären Wachstums nach partieller Hepatektomie in Mäusen hergestellt.
Es gibt eine Reihe von kritischen Schritte Aufmerksamkeit benötigen gute Perfusion…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding by the German Ministry of Education and Research (BMBF) via the systems biology network “Virtual Liver”, grant numbers 0315743 (ExMI), 0315765 (UK Jena), 0315769 (MEVIS).The authors also thank Frank Schubert for technical support.
Materials
| PERFUSOR® VI | B.BRAUN | 87 222/0 | |
| Pipetus®-akku | Hirschmann | 9907200 | |
| Pipets | Greiner | 606180 | |
| micro scissors | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 14058-09 | |
| micro serrefine | Fine Science Tools (F·S·L) | No.18055-05 | |
| Micro clamps applicator | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 18057-14 | |
| Straight micro forceps | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 00632-11 | |
| Curved micro forceps | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 00649-11 | |
| needle-holder | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 12061-01 | |
| 1ml syringe | B.Braun | 9161406V | |
| 5ml syringe | B.Braun | 4606051V | |
| extension and connection lines | B.Braun | 4256000 | 30cm, inner ø1.2mm |
| 6-0 silk (Perma-Hand Seide) | Ethicon | 639H | |
| 6-0 prolene | Ethicon | 8711H | |
| Microfil® MV diluent | FLOW TECH, INC | ||
| Microfil® MV – 120 | FLOW TECH, INC | MV – 120 (blue) | |
| MV curing agent | FLOW TECH, INC | ||
| Heparin 2500 I.E./5ml | Rotexmedica | ETI3L318-15 | |
| Saline | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | E15117/D DE | |
| Imalytics Preclinical software | Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, Germany | ||
| HepaVision | Fraunhofer MEVIS, Bremen, Germany | ||
| NanoZoomer 2.0-HT Digital slide scanner | Hamamatsu Electronic Press, Japan | C9600 | |
| Tomoscope Duo CT | CT Imaging GmbH, Erlangen, Germany | TomoScope® Synergy | |
Riferimenti
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