Visualisatie van vasculaire en Parenchymale Regeneratie na 70% Gedeeltelijke hepatectomy in normale muizen
Summary
Tools used for visualizing vascular regeneration require methods for contrasting the vascular trees. This film demonstrated a delicate injection technique used to achieve optimal contrasting of the vascular trees and illustrate the potential benefits resulting from a detailed analysis of the resulting specimen using µCT and histological serial sections.
Abstract
Een gemodificeerde silicone injectieprocedure werd gebruikt voor visualisatie van de lever vaatstelsel. Deze bestond uit het in vivo injectie van de silicone verbinding, via een katheter 26 G, in het portaal of de vena hepatica. Na silicone injectie werden organen geëxplanteerd en voorbereid voor ex-vivo micro-CT (μCT) scannen. De siliconen injectie procedure is technisch uitdagend. Het bereiken van een succesvol resultaat vergt veel microchirurgische ervaring van de chirurg. Een van de uitdagingen van deze procedure houdt de bepaling van de adequate perfusiesnelheid de siliconenverbinding. De perfusiesnelheid van de silicone verbinding moet worden gedefinieerd op basis van de hemodynamische van het vaatstelsel van belang. Ongepast perfusie tarief kan leiden tot een onvolledige perfusie, kunstmatige dilatatie en scheuren van vasculaire bomen.
De 3D reconstructie van het vasculaire systeem is gebaseerd op CT-scans en werd bereikt met behulppreklinische software zoals HepaVision. De kwaliteit van de gereconstrueerde vasculaire boom is direct gerelateerd aan de kwaliteit van siliconen perfusie. Vervolgens berekende vasculaire parameters voor vasculaire groei, zoals vasculaire totale volume werd berekend op basis van de vasculaire reconstructies. Contrasterende de vasculaire boom met siliconen toegestaan voor verdere histologische work-up van het monster na μCT scannen. Het monster kan worden onderworpen aan seriële snijden, histologische analyse en objectglaasje scannen en daarna 3D reconstructie van het vasculaire bomen op basis van histologische afbeeldingen. Dit is een voorwaarde voor de detectie van moleculaire gebeurtenissen en hun verdeling met betrekking tot het vaatstelsel. Deze gemodificeerde siliconen injectieprocedure kan ook worden gebruikt voor het visualiseren en reconstrueren de vasculaire systemen van andere organen. Deze techniek heeft het potentieel uitgebreid worden toegepast op studies over vasculaire anatomie en groei van diverse dierlijke eenziektemodellen nd.
Introduction
Leverregeneratie wordt vaak bepaald door de toename van de lever gewicht en volume en door beoordeling van de hepatocyt proliferatiesnelheid 16. Echter, wordt de lever regeneratie niet alleen inducerende parenchymale regeneratie, maar ook vasculaire regeneratie 6. Daarom moet de groei van vasculaire nader worden onderzocht met betrekking tot zijn rol in de progressie van leverregeneratie. Visualisatie van de lever vasculaire systeem is cruciaal voor het bevorderen van ons begrip van vasculaire regeneratie. Talrijke indirecte methoden ontwikkeld om de onderliggende moleculaire mechanismen van hepatische regeneratie vasculaire onderzoeken. Traditioneel detectie van cytokinen (vasculaire endotheliale groeifactor, VEGF) 14, chemokinen en hun receptoren (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12) 4 zijn de steunpilaar voor het bestuderen van vasculaire regeneratie geweest. Echter, een 3D-model, met kwantitatieve analyse van de vasculatuur kritische anatomische toevoegenaan een beter begrip van de belangrijke relatie tussen parenchymale en vasculaire regeneratie krijgen.
Om de lever vasculaire systeem, dat vereist contrasterende het vasculaire bomen te visualiseren, werden muizen geïnjecteerd met een radiopake siliconenrubber contrastmiddel direct in de portal of leverinsufficiëntie veneuze vasculaire boom. Na polymerisatie van de silicone en uitname van het orgaan, werden de lever monsters onderworpen aan μCT scannen met een CT-scanner. De scans resulteerde in voxel afbeelding representaties van de siliconen-injectie specimens 9.
Voor kwaliteitscontrole, werd het vasculaire systeem voor het eerst gevisualiseerd in 3D met behulp van preklinische software. Segmentatie werd uitgevoerd door een drempel tussen het zachte weefsel intensiteit en de intensiteit vat. Het verkregen masker vat werd zichtbaar gemaakt met oppervlak rendering. De software werd ook rekening handmatig bepalen van twee parameters van Vascular groei: maximale scheepslengte en radius.
Een preklinische software werd vervolgens gebruikt voor 3D-reconstructie van vasculaire bomen en nacalculatie van de toe- of afvoer van vasculaire gebieden 13. Daarnaast is deze software automatisch bepaald aantal parameters van vasculaire groei, zoals de totale lengte van alle zichtbare vasculaire structuren ook bekend als de totale ribbe of totale verblijf.
De siliconen perfusie procedure werd uitgevoerd bij naïeve muizen en in muizen die onderging 70% gedeeltelijke hepatectomie (PH). Levers werden verzameld op verschillende observatie tijdstippen na resectie voor het analyseren van vasculaire en parenchymale leverregeneratie met behulp van de eerder genoemde visualisatie en kwantificering techniek.
De hoofddoelen van deze film zijn: (1) tonen de delicate injectie-techniek vereist om optimale contrasterende en (2) tonen de mogelijke voordelen verkregen fr verwezenlijkenOM een gedetailleerde analyse van de resulterende monster met behulp van μCT en histologische seriecoupes. Na het bekijken van deze film wordt de lezer een beter begrip van hoe siliconeverbinding injecteren in een specifieke vaatstelsel en het nut en de toepasbaarheid van de techniek hebben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Contrasterende de vasculaire boom door siliconen injectie en μCT scanning is geïntroduceerd in tumor modellen en neurologische ziekte modellen vaak naar de angiogene progressie 5,7,8,10 bestuderen. Verbeteringen in de methodologie van siliconen injectie werden gemaakt in de huidige studie voor het visualiseren en kwantificeren van vasculaire groei na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen.
Er zijn een aantal kritische stappen aandacht nodig om goede perfusie kwaliteit. Allereerst…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding by the German Ministry of Education and Research (BMBF) via the systems biology network “Virtual Liver”, grant numbers 0315743 (ExMI), 0315765 (UK Jena), 0315769 (MEVIS).The authors also thank Frank Schubert for technical support.
Materials
| PERFUSOR® VI | B.BRAUN | 87 222/0 | |
| Pipetus®-akku | Hirschmann | 9907200 | |
| Pipets | Greiner | 606180 | |
| micro scissors | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 14058-09 | |
| micro serrefine | Fine Science Tools (F·S·L) | No.18055-05 | |
| Micro clamps applicator | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 18057-14 | |
| Straight micro forceps | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 00632-11 | |
| Curved micro forceps | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 00649-11 | |
| needle-holder | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 12061-01 | |
| 1ml syringe | B.Braun | 9161406V | |
| 5ml syringe | B.Braun | 4606051V | |
| extension and connection lines | B.Braun | 4256000 | 30cm, inner ø1.2mm |
| 6-0 silk (Perma-Hand Seide) | Ethicon | 639H | |
| 6-0 prolene | Ethicon | 8711H | |
| Microfil® MV diluent | FLOW TECH, INC | ||
| Microfil® MV – 120 | FLOW TECH, INC | MV – 120 (blue) | |
| MV curing agent | FLOW TECH, INC | ||
| Heparin 2500 I.E./5ml | Rotexmedica | ETI3L318-15 | |
| Saline | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | E15117/D DE | |
| Imalytics Preclinical software | Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, Germany | ||
| HepaVision | Fraunhofer MEVIS, Bremen, Germany | ||
| NanoZoomer 2.0-HT Digital slide scanner | Hamamatsu Electronic Press, Japan | C9600 | |
| Tomoscope Duo CT | CT Imaging GmbH, Erlangen, Germany | TomoScope® Synergy | |
References
- Bearden, S. E., Segal, S. S. Neurovascular alignment in adult mouse skeletal muscles. Microcirculation. 12 (2), 161-167 (2005).
- Brown, R. P., Delp, M. D., Lindstedt, S. L., Rhomberg, L. R., Beliles, R. P. Physiological parameter values for physiologically based pharmacokinetic models. Toxicol.Ind.Health. 13 (4), 407-484 (1997).
- Dai, D., et al. Elastase-Induced Intracranial Dolichoectasia Model in Mice. Neurosurgery. , (2015).
- Ding, B. S., et al. Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration. Nature. 468 (7321), 310-315 (2010).
- Downey, C. M., et al. Quantitative ex-vivo micro-computed tomographic imaging of blood vessels and necrotic regions within tumors. PLoS.One. 7 (7), 41685 (2012).
- Ehling, J., et al. CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis. Gut. , (2014).
- Ehling, J., et al. Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization. Am.J.Pathol. 184 (2), 431-441 (2014).
- Ghanavati, S., Yu, L. X., Lerch, J. P., Sled, J. G. A perfusion procedure for imaging of the mouse cerebral vasculature by X-ray micro-CT. J.Neurosci.Methods. 221, 70-77 (2014).
- Gremse, F., et al. Hybrid microCT-FMT imaging and image analysis. J.Vis.Exp. (100), (2015).
- Jing, X. L., et al. Radiomorphometric quantitative analysis of vasculature utilizing micro-computed tomography and vessel perfusion in the murine mandible. Craniomaxillofac.Trauma Reconstr. 5 (4), 223-230 (2012).
- Melloul, E., et al. Small animal magnetic resonance imaging: an efficient tool to assess liver volume and intrahepatic vascular anatomy. J.Surg.Res. 187 (2), 458-465 (2014).
- Schwier, M., Bohler, T., Hahn, H. K., Dahmen, U., Dirsch, O. Registration of histological whole slide images guided by vessel structures. J.Pathol.Inform. 4 ((Suppl)), 10 (2013).
- Selle, D., Preim, B., Schenk, A., Peitgen, H. O. Analysis of vasculature for liver surgical planning. IEEE Trans.Med.Imaging. 21 (11), 1344-1357 (2002).
- Shergill, U., et al. Inhibition of of VEGF- and NO-dependent angiogenesis does not impair liver regeneration. Am.J.Physiol Regul.Integr.Comp Physiol. 298 (5), 1279-1287 (2010).
- Sueyoshi, R., Ralls, M. W., Teitelbaum, D. H. Glucagon-like peptide 2 increases efficacy of distraction enterogenesis. J.Surg.Res. 184 (1), 365-373 (2013).
- Wei, W., et al. Rodent models and imaging techniques to study liver regeneration. Eur.Surg.Res. 54 (3-4), 97-113 (2015).
- Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. J.Vis.Exp. (92), e51955 (2014).
