ויזואליזציה של התחדשות כלי דם Parenchymal לאחר 70% חלקיות כריתה בעכברים נורמליים
Summary
Tools used for visualizing vascular regeneration require methods for contrasting the vascular trees. This film demonstrated a delicate injection technique used to achieve optimal contrasting of the vascular trees and illustrate the potential benefits resulting from a detailed analysis of the resulting specimen using µCT and histological serial sections.
Abstract
הליך הזרקת סיליקון שונה שמש להדמיה של עץ כלי הדם בכבד. הליך זה כלל הזרקה ב- vivo של מתחם סיליקון, באמצעות קטטר 26 G, לתוך הפורטל או הווריד כבד. לאחר הזרקת סיליקון, האיברים היו explanted והכינו לסריקה לשעבר vivo מיקרו-CT (μCT). ההליך הזרקת סיליקון הוא מאתגר מבחינה טכנית. השיג תוצאה מוצלחת דורש ניסיון microsurgical נרחב של המנתח. אחד האתגרים של הליך זה כרוך בקביעת שיעור זלוף ההולם במתחם סיליקון. שיעור זלוף עבור מתחם סיליקון צריך להיות מוגדר על בסיס המודינמי של מערכת כלי הדם של עניין. שיעור זלוף לא ראוי יכול להוביל זלוף שלם, התרחבות מלאכותית פקיעת עצים וסקולרית.
שחזור 3D של מערכת כלי הדם התבסס על בדיקות CT ו הושג באמצעותתוכנת פרה-קלינית כגון HepaVision. איכות עץ כלי הדם המשוחזר הייתה קשורה ישירות לאיכות זלוף סיליקון. בהמשך מחושבים פרמטרים וסקולרית מעידים על צמיחה של כלי דם, כגון נפח כלי דם הכולל, חושבו על בסיס השחזורים וסקולרית. הניגודיות את העץ וסקולרית עם סיליקון מותר לעבודה-אפ היסטולוגית עוקב של הדגימה לאחר סריקת μCT. הדגימה יכולה להיות נתונה חתך סדרתי, ניתוח היסטולוגית וסריקה השקופית כולה, ולאחר מכן כדי שחזור 3D של העצים וסקולרית המבוססת על תמונות היסטולוגית. זהו התנאים ההכרחיים לצורך זיהוי של אירועים מולקולריים והפצתי ביחס עץ כלי הדם. הליך להזרקת סיליקון שונה זה יכול לשמש גם כדי לחזות לשחזר את מערכות כלי הדם של איברים אחרים. טכניקה זו יש פוטנציאל להיות מיושם באופן נרחב כדי מחקרים לגבי האנטומיה של כלי הדם וצמיחה בתוך בעלי חיים שוניםמודלים המחלה nd.
Introduction
התחדשות כבדה לעתים קרובות נקבעת על ידי מדידת העלייה במשקל כבד נפח על ידי בחינה של קצב התפשטות hepatocyte 16. עם זאת, התחדשות כבדה אינה רק גרימת התחדשות parenchymal אבל גם 6 התחדשות כלי דם. לכן, צמיחה של כלי דם צריכה להיחקר נוסף באשר לתפקידה בהתקדמות של התחדשות כבדה. ויזואליזציה של מערכת כלי דם בכבד היא קריטית לקידום הבנתנו התחדשות כלי דם. רבים בשיטות עקיפות פותחו כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס של התחדשות כלי הדם בכבד. באופן מסורתי, זיהוי של ציטוקינים (פקטור הגדילה של אנדותל כלי הדם, VEGF) 14, כמוקינים ואת הקולטנים שלהם (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12) 4 היו עמוד התווך ללימוד התחדשות כלי הדם. עם זאת, מודל 3D יחד עם ניתוח כמותי של כלי הדם יוסיף אנטומיים קריטימידע כדי להשיג הבנה טובה יותר של מערכת היחסים החשובים בין parenchymal הכבד והתחדשות כלי דם.
כדי להמחיש את מערכת כלי דם בכבד, מחייב מנוגדי העצים וסקולרית, עכברים הזריקו חומר ניגוד גומי סיליקון radiopaque ישירות לתוך הפורטל או עץ כלי דם מוריד בכבד. לאחר פילמור של סיליקון explantation של האיבר, הדגימות הכבדות היו נתוני סריקת μCT באמצעות סורק CT. הסריקות הביאו ייצוגי תמונת voxel של הזרקת סיליקון דגימות 9.
עבור בקרת איכות, מערכת כלי הדם הייתה מדמיין הראשון 3D באמצעות תוכנת פרה-קלינית. פילוח בוצע על ידי קביעת סף בין עוצמת רקמות הרכה לבין עוצמת הכלי. מסכת הכלי וכתוצאה מכך הייתה דמיינה באמצעות טיוח משטח. התוכנה אפשרה גם זיהוי ידני של שני פרמטרים של vasculצמיחת ar: Vessel אורך מקסימאלי ורדיוס.
תוכנת פרה-מכן שמשה שחזור 3D של עצים וסקולרית והחישוב הבא של השטחים וסקולרית באספקה או ניקוז 13. בנוסף, תוכנה זו באופן אוטומטי נקבעה פרמטרים מסוימים של צמיחה של כלי דם, כגון האורך הכולל של כל המבנים וסקולרית הגלויים הידוע גם בשם אורך הקצה המוחלט או נפח כלי כולל.
הליך סיליקון זלוף בוצע בעכברים נאיביים בעכברים שעברו 70% כריתה חלקית (PH). כבד נאספו בנקודות שונות מדידה לאחר כריתה לניתוח ההתחדשות כבדה של כלי דם ואת parenchymal בטכניקה להדמיה וכימות הנ"ל.
המטרות העיקריות של הסרט הזה הן: (1) להדגים את טכניקת ההזרקה העדינה נדרשה להשיג מנוגדים אופטימליים (2) הצגת תרומה האפשרית כתוצאת frאום ניתוח מפורט של הדגימה וכתוצאה מכך באמצעות μCT וחתכים סדרתי היסטולוגית. לאחר הצפייה בסרט זה, הקורא צריך להיות בעל הבנה טובה יותר של כיצד להזריק תרכובת סיליקון לתוך מערכת כלי דם ספציפית של תועלת תחולתה של הטכניקה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הניגודיות את עץ כלי הדם על ידי הזרקת סיליקון וסריקה μCT כבר הציג מודלים הגידול ומודלים מחלה נוירולוגית לעתים קרובות כדי ללמוד את התקדמות angiogenic 5,7,8,10. שיפורים במתודולוגיה של הזרקת סיליקון נעשו במחקר הנוכחי המאפשרים הדמיה לכימות צמיחה של כלי דם לאחר כריתה חלקית ב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding by the German Ministry of Education and Research (BMBF) via the systems biology network “Virtual Liver”, grant numbers 0315743 (ExMI), 0315765 (UK Jena), 0315769 (MEVIS).The authors also thank Frank Schubert for technical support.
Materials
| PERFUSOR® VI | B.BRAUN | 87 222/0 | |
| Pipetus®-akku | Hirschmann | 9907200 | |
| Pipets | Greiner | 606180 | |
| micro scissors | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 14058-09 | |
| micro serrefine | Fine Science Tools (F·S·L) | No.18055-05 | |
| Micro clamps applicator | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 18057-14 | |
| Straight micro forceps | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 00632-11 | |
| Curved micro forceps | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 00649-11 | |
| needle-holder | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 12061-01 | |
| 1ml syringe | B.Braun | 9161406V | |
| 5ml syringe | B.Braun | 4606051V | |
| extension and connection lines | B.Braun | 4256000 | 30cm, inner ø1.2mm |
| 6-0 silk (Perma-Hand Seide) | Ethicon | 639H | |
| 6-0 prolene | Ethicon | 8711H | |
| Microfil® MV diluent | FLOW TECH, INC | ||
| Microfil® MV – 120 | FLOW TECH, INC | MV – 120 (blue) | |
| MV curing agent | FLOW TECH, INC | ||
| Heparin 2500 I.E./5ml | Rotexmedica | ETI3L318-15 | |
| Saline | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | E15117/D DE | |
| Imalytics Preclinical software | Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, Germany | ||
| HepaVision | Fraunhofer MEVIS, Bremen, Germany | ||
| NanoZoomer 2.0-HT Digital slide scanner | Hamamatsu Electronic Press, Japan | C9600 | |
| Tomoscope Duo CT | CT Imaging GmbH, Erlangen, Germany | TomoScope® Synergy | |
References
- Bearden, S. E., Segal, S. S. Neurovascular alignment in adult mouse skeletal muscles. Microcirculation. 12 (2), 161-167 (2005).
- Brown, R. P., Delp, M. D., Lindstedt, S. L., Rhomberg, L. R., Beliles, R. P. Physiological parameter values for physiologically based pharmacokinetic models. Toxicol.Ind.Health. 13 (4), 407-484 (1997).
- Dai, D., et al. Elastase-Induced Intracranial Dolichoectasia Model in Mice. Neurosurgery. , (2015).
- Ding, B. S., et al. Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration. Nature. 468 (7321), 310-315 (2010).
- Downey, C. M., et al. Quantitative ex-vivo micro-computed tomographic imaging of blood vessels and necrotic regions within tumors. PLoS.One. 7 (7), 41685 (2012).
- Ehling, J., et al. CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis. Gut. , (2014).
- Ehling, J., et al. Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization. Am.J.Pathol. 184 (2), 431-441 (2014).
- Ghanavati, S., Yu, L. X., Lerch, J. P., Sled, J. G. A perfusion procedure for imaging of the mouse cerebral vasculature by X-ray micro-CT. J.Neurosci.Methods. 221, 70-77 (2014).
- Gremse, F., et al. Hybrid microCT-FMT imaging and image analysis. J.Vis.Exp. (100), (2015).
- Jing, X. L., et al. Radiomorphometric quantitative analysis of vasculature utilizing micro-computed tomography and vessel perfusion in the murine mandible. Craniomaxillofac.Trauma Reconstr. 5 (4), 223-230 (2012).
- Melloul, E., et al. Small animal magnetic resonance imaging: an efficient tool to assess liver volume and intrahepatic vascular anatomy. J.Surg.Res. 187 (2), 458-465 (2014).
- Schwier, M., Bohler, T., Hahn, H. K., Dahmen, U., Dirsch, O. Registration of histological whole slide images guided by vessel structures. J.Pathol.Inform. 4 ((Suppl)), 10 (2013).
- Selle, D., Preim, B., Schenk, A., Peitgen, H. O. Analysis of vasculature for liver surgical planning. IEEE Trans.Med.Imaging. 21 (11), 1344-1357 (2002).
- Shergill, U., et al. Inhibition of of VEGF- and NO-dependent angiogenesis does not impair liver regeneration. Am.J.Physiol Regul.Integr.Comp Physiol. 298 (5), 1279-1287 (2010).
- Sueyoshi, R., Ralls, M. W., Teitelbaum, D. H. Glucagon-like peptide 2 increases efficacy of distraction enterogenesis. J.Surg.Res. 184 (1), 365-373 (2013).
- Wei, W., et al. Rodent models and imaging techniques to study liver regeneration. Eur.Surg.Res. 54 (3-4), 97-113 (2015).
- Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. J.Vis.Exp. (92), e51955 (2014).
