Visualizzazione dei Vascolare e parenchimale rigenerazione dopo il 70% epatectomia parziale in topi normali
Summary
Tools used for visualizing vascular regeneration require methods for contrasting the vascular trees. This film demonstrated a delicate injection technique used to achieve optimal contrasting of the vascular trees and illustrate the potential benefits resulting from a detailed analysis of the resulting specimen using µCT and histological serial sections.
Abstract
Una procedura di iniezione silicone modificato è stato utilizzato per la visualizzazione dell'albero vascolare epatica. Questa procedura consisteva di iniezione in vivo del composto siliconico, tramite un catetere di G 26, nel portale o vena epatica. Dopo l'iniezione di silicone, organi sono stati espiantati e preparate per la scansione ex-vivo micro-CT (μCT). La procedura di iniezione di silicone è tecnicamente impegnativo. Il raggiungimento di un risultato di successo richiede una vasta esperienza microchirurgico dal chirurgo. Una delle sfide di questa procedura consiste nel determinare il tasso di perfusione adeguata per il composto di silicone. Il tasso di perfusione per il composto di silicone deve essere definito in base al emodinamica del sistema vascolare di interesse. tasso di perfusione inappropriato può portare ad una perfusione incompleta, la dilatazione artificiale e rottura di alberi vascolari.
La ricostruzione 3D del sistema vascolare era basato su TAC e stata ottenuta utilizzandosoftware preclinica quali HepaVision. La qualità dell'albero vascolare ricostruito era direttamente correlato alla qualità di perfusione silicone. parametri vascolari Successivamente calcolati indicativi di crescita vascolare, come il volume vascolare totale, sono stati calcolati sulla base delle ricostruzioni vascolari. Contrasto dell'albero vascolare con silicone consentito per il successivo work-up istologico del campione dopo la scansione μCT. Il campione possono essere sottoposti a sezioni seriate, analisi istologica e scansione scivolo intero, e successivamente alla ricostruzione 3D degli alberi vascolari basati su immagini istologiche. Questo è il presupposto per la rilevazione di eventi molecolari e la loro distribuzione rispetto alla dell'albero vascolare. Questa procedura di iniezione silicone modificato può anche essere utilizzato per visualizzare e ricostruire i sistemi vascolari di altri organi. Questa tecnica ha il potenziale per essere applica estesamente agli studi riguardanti l'anatomia vascolare e la crescita in vari un animalemodelli di malattia ND.
Introduction
Rigenerazione epatica è spesso determinato misurando l'aumento del peso del fegato e del volume e valutando il tasso di proliferazione epatociti 16. Tuttavia, la rigenerazione del fegato è non solo induce la rigenerazione parenchimale ma anche la rigenerazione vascolare 6. Pertanto, crescita vascolare debbano esaminare ulteriormente rispetto al suo ruolo nella progressione della rigenerazione epatica. La visualizzazione del sistema vascolare epatico è fondamentale per far progredire la nostra comprensione della rigenerazione vascolare. Numerosi metodi indiretti sono stati sviluppati per studiare i meccanismi molecolari alla base della rigenerazione vascolare epatico. Tradizionalmente, l'individuazione di citochine (fattore di crescita vascolare endoteliale, VEGF) 14, chemochine ei loro recettori (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12) 4 sono stati il pilastro per studiare la rigenerazione vascolare. Tuttavia, un modello 3D insieme con l'analisi quantitativa del sistema vascolare aggiungerebbe anatomica criticainformazioni per ottenere una migliore comprensione del rapporto importante tra la parenchima epatico e la rigenerazione vascolare.
Per visualizzare il sistema vascolare epatica, che richiede contrasto alberi vascolari, i topi sono stati iniettati con un agente di contrasto radiopaco gomma siliconica direttamente nel portale o dell'albero vascolare venosa epatica. Dopo la polimerizzazione del silicone e espianto dell'organo, i campioni di fegato sono stati sottoposti a scansione μCT utilizzando uno scanner CT. Le scansioni hanno portato nelle rappresentazioni di immagini voxel del silicone-iniezione esemplari 9.
Per controllo di qualità, il sistema vascolare è stato visualizzato in 3D utilizzando il software preclinico. Segmentazione stata eseguita impostando una soglia tra l'intensità tessuto molle e l'intensità nave. La maschera nave risultante è stato visualizzato usando il rendering di superficie. Il software ha permesso anche di determinare manualmente la due parametri di vasculla crescita ar: lunghezza dell'imbarcazione massima e raggio.
Un software preclinico è stato poi utilizzato per la ricostruzione 3D di alberi vascolari e successivo calcolo dei forniscono o drenanti territori vascolari 13. Inoltre, questo software determinato automaticamente alcuni parametri di crescita vascolare, come la lunghezza totale di tutte le strutture vascolari visibili noto anche come la lunghezza bordo o il volume totale del serbatoio.
La procedura di perfusione silicone è stata eseguita in topi naive e nei topi che hanno subito il 70% epatectomia parziale (PH). I fegati sono stati raccolti in diversi momenti di osservazione dopo resezione per analizzare la rigenerazione del fegato e vascolare parenchimale utilizzando la suddetta tecnica di visualizzazione e la quantificazione.
Gli obiettivi principali di questo film sono: (1) dimostrare la delicata iniezione-tecnica necessaria per raggiungere contrasto ottimale e (2) dimostrare il potenziale beneficio derivante from una dettagliata analisi del campione derivanti utilizzando μCT e sezioni seriali istologiche. Dopo aver visto questo film, il lettore dovrebbe avere una migliore comprensione di come iniettare composto di silicone in un sistema vascolare specifico e l'utilità e applicabilità della tecnica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Contrasto dell'albero vascolare mediante iniezione di silicone e scansione μCT è stata introdotta in modelli tumorali e modelli di malattie neurologiche frequentemente per studiare la progressione angiogenico 5,7,8,10. Miglioramenti nella metodologia di iniezione di silicone sono state fatte in questo studio per la visualizzazione e la quantificazione di crescita vascolare dopo epatectomia parziale in topi.
Ci sono un certo numero di passaggi critici che richiedono attenzion…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding by the German Ministry of Education and Research (BMBF) via the systems biology network “Virtual Liver”, grant numbers 0315743 (ExMI), 0315765 (UK Jena), 0315769 (MEVIS).The authors also thank Frank Schubert for technical support.
Materials
| PERFUSOR® VI | B.BRAUN | 87 222/0 | |
| Pipetus®-akku | Hirschmann | 9907200 | |
| Pipets | Greiner | 606180 | |
| micro scissors | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 14058-09 | |
| micro serrefine | Fine Science Tools (F·S·L) | No.18055-05 | |
| Micro clamps applicator | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 18057-14 | |
| Straight micro forceps | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 00632-11 | |
| Curved micro forceps | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 00649-11 | |
| needle-holder | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 12061-01 | |
| 1ml syringe | B.Braun | 9161406V | |
| 5ml syringe | B.Braun | 4606051V | |
| extension and connection lines | B.Braun | 4256000 | 30cm, inner ø1.2mm |
| 6-0 silk (Perma-Hand Seide) | Ethicon | 639H | |
| 6-0 prolene | Ethicon | 8711H | |
| Microfil® MV diluent | FLOW TECH, INC | ||
| Microfil® MV – 120 | FLOW TECH, INC | MV – 120 (blue) | |
| MV curing agent | FLOW TECH, INC | ||
| Heparin 2500 I.E./5ml | Rotexmedica | ETI3L318-15 | |
| Saline | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | E15117/D DE | |
| Imalytics Preclinical software | Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, Germany | ||
| HepaVision | Fraunhofer MEVIS, Bremen, Germany | ||
| NanoZoomer 2.0-HT Digital slide scanner | Hamamatsu Electronic Press, Japan | C9600 | |
| Tomoscope Duo CT | CT Imaging GmbH, Erlangen, Germany | TomoScope® Synergy | |
Riferimenti
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