Визуализация сосудистой и паренхиматозных регенерации после того, как 70% частичной гепатэктомии у нормальных мышей
Summary
Tools used for visualizing vascular regeneration require methods for contrasting the vascular trees. This film demonstrated a delicate injection technique used to achieve optimal contrasting of the vascular trees and illustrate the potential benefits resulting from a detailed analysis of the resulting specimen using µCT and histological serial sections.
Abstract
Модифицированная процедура инъекции силиконовое использовалась для визуализации печени сосудистого дерева. Эта процедура состояла из в естественных условиях введения силиконового соединения, через 26 G катетер, в портал или печеночной вены. После инъекции силикона, органы были эксплантировали и подготовлены для экс-естественных условиях микро-КТ (μCT) сканирования. Процедура инъекции силикона является технически сложной задачей. Достижение успешных результатов требует обширных микрохирургического опыта от хирурга. Одна из задач этой процедуры заключается в определении адекватной скорости перфузии для силиконового соединения. Скорость перфузии для силиконового соединения должна быть определена на основе гемодинамических сосудистой системы, представляющей интерес. Неуместный скорость перфузии может привести к неполному перфузией, искусственное расширение и разрыв сосудистых деревьев.
3D реконструкция сосудистой системы была основана на КТ и была достигнута с помощьюдоклинические программного обеспечения, таких как HepaVision. Качество восстановленного сосудистого дерева была непосредственно связана с качеством силиконового перфузией. Впоследствии, вычисляемые сосудистые параметры, указывающие роста сосудов, такие как общего сосудистого объема, были рассчитаны на основе сосудистых реконструкций. Контрастные сосудистого дерева с силиконом, предоставляемое для последующего гистологического работы вверх образца после сканирования μCT. Образец может быть подвергнут серийному секционирования, гистологического анализа и целого сканирования слайдов, а затем в 3D-реконструкция сосудистых деревьев, основанных на гистологических изображениях. Это является предпосылкой для обнаружения молекулярных событий и их распределение по сосудистого дерева. Эта модифицированная процедура инъекции силикон также может быть использован для визуализации и реконструкции сосудистой системы других органов. Этот метод имеет потенциал, чтобы быть широко применяется для исследований в отношении сосудистой анатомии и роста в различных животных аМодели болезни НД.
Introduction
Регенерации печени часто определяется путем измерения увеличения веса печени и объема , и путем оценки скорости пролиферации гепатоцитов 16. Тем не менее, регенерация печени не только вызывая регенерацию паренхимы , но и регенерации сосудистой 6. Таким образом, рост сосудов следует провести дальнейшее расследование в отношении его роли в прогрессии регенерации печени. Визуализация печеночной сосудистой системы имеет решающее значение для углубления нашего понимания сосудистой регенерации. Многочисленные косвенные методы были разработаны для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе печеночной сосудистой регенерации. Традиционно, обнаружение цитокинов (фактор роста эндотелия сосудов, VEGF) , 14, хемокинов и их рецепторов (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12) 4 был основой для изучения регенерации сосудов. Тем не менее, 3D-модель вместе с количественным анализом сосудистую добавило бы критическую анатомическиеИнформация, чтобы получить лучшее представление о важной взаимосвязи между печеночной паренхимы и регенерации сосудов.
Для визуализации печени сосудистой системы, которая требует контрастный сосудистых деревьев, мышам вводили рентгеноконтрастного силиконового каучука контрастного вещества непосредственно в портал или печеночной венозного сосудистого дерева. После полимеризации силикона и УВК органа, образцы печени были подвергнуты сканированию μCT использованием томограф. Сканирование привело к воксельных представлений изображений из кремнийорганической инъекции образцов 9.
Для контроля качества, сосудистая система была впервые визуализируется в 3D с использованием доклинических программного обеспечения. Сегментация была выполнена путем установки порога между интенсивностью мягких тканей и интенсивности сосуда. Полученная маска судно визуализировали с использованием визуализации поверхности. Программное обеспечение также разрешено для ручного определения двух параметров vasculаг роста: максимальная длина судна и радиус.
Затем Доклинические программное обеспечение было использовано для 3D реконструкции сосудистых деревьев и последующего расчета питающих или дренирующих сосудистых территорий 13. Кроме того, это программное обеспечение автоматически определены некоторые параметры роста сосудов, такие как общая длина всех видимых сосудистых структур, известных также как общая длина кромок или общего объема сосуда.
Процедура силиконовый перфузию проводили в простых мышей и у мышей, которые подверглись 70% частичной гепатэктомии (PH). Печени собраны в различные моменты времени наблюдения после резекции для анализа сосудистой и паренхиматозной регенерации печени с использованием вышеупомянутого визуализации и количественного определения техники.
Основными целями этого фильма являются: (1) демонстрируют хрупкое литьевого технику, необходимое для достижения оптимального контрастирование и (2) показывают потенциальные выгоды в результате фром детальный анализ полученных образцов с использованием μCT и гистологические серийных срезов. После просмотра этого фильма, читатель должен иметь лучшее понимание того, как придать силиконовое соединение в специфическую сосудистую систему и полезности и применимости методики.
Protocol
Representative Results
Discussion
Контрастные сосудистого дерева путем инъекции силикона и сканирования μCT была введена в опухолевых моделях и неврологических моделях болезни часто для изучения кровеносных сосудов прогрессирование 5,7,8,10. Улучшения в методологии инъекции силикона были сделаны в настоящем иссл?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding by the German Ministry of Education and Research (BMBF) via the systems biology network “Virtual Liver”, grant numbers 0315743 (ExMI), 0315765 (UK Jena), 0315769 (MEVIS).The authors also thank Frank Schubert for technical support.
Materials
| PERFUSOR® VI | B.BRAUN | 87 222/0 | |
| Pipetus®-akku | Hirschmann | 9907200 | |
| Pipets | Greiner | 606180 | |
| micro scissors | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 14058-09 | |
| micro serrefine | Fine Science Tools (F·S·L) | No.18055-05 | |
| Micro clamps applicator | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 18057-14 | |
| Straight micro forceps | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 00632-11 | |
| Curved micro forceps | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 00649-11 | |
| needle-holder | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 12061-01 | |
| 1ml syringe | B.Braun | 9161406V | |
| 5ml syringe | B.Braun | 4606051V | |
| extension and connection lines | B.Braun | 4256000 | 30cm, inner ø1.2mm |
| 6-0 silk (Perma-Hand Seide) | Ethicon | 639H | |
| 6-0 prolene | Ethicon | 8711H | |
| Microfil® MV diluent | FLOW TECH, INC | ||
| Microfil® MV – 120 | FLOW TECH, INC | MV – 120 (blue) | |
| MV curing agent | FLOW TECH, INC | ||
| Heparin 2500 I.E./5ml | Rotexmedica | ETI3L318-15 | |
| Saline | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | E15117/D DE | |
| Imalytics Preclinical software | Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, Germany | ||
| HepaVision | Fraunhofer MEVIS, Bremen, Germany | ||
| NanoZoomer 2.0-HT Digital slide scanner | Hamamatsu Electronic Press, Japan | C9600 | |
| Tomoscope Duo CT | CT Imaging GmbH, Erlangen, Germany | TomoScope® Synergy | |
References
- Bearden, S. E., Segal, S. S. Neurovascular alignment in adult mouse skeletal muscles. Microcirculation. 12 (2), 161-167 (2005).
- Brown, R. P., Delp, M. D., Lindstedt, S. L., Rhomberg, L. R., Beliles, R. P. Physiological parameter values for physiologically based pharmacokinetic models. Toxicol.Ind.Health. 13 (4), 407-484 (1997).
- Dai, D., et al. Elastase-Induced Intracranial Dolichoectasia Model in Mice. Neurosurgery. , (2015).
- Ding, B. S., et al. Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration. Nature. 468 (7321), 310-315 (2010).
- Downey, C. M., et al. Quantitative ex-vivo micro-computed tomographic imaging of blood vessels and necrotic regions within tumors. PLoS.One. 7 (7), 41685 (2012).
- Ehling, J., et al. CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis. Gut. , (2014).
- Ehling, J., et al. Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization. Am.J.Pathol. 184 (2), 431-441 (2014).
- Ghanavati, S., Yu, L. X., Lerch, J. P., Sled, J. G. A perfusion procedure for imaging of the mouse cerebral vasculature by X-ray micro-CT. J.Neurosci.Methods. 221, 70-77 (2014).
- Gremse, F., et al. Hybrid microCT-FMT imaging and image analysis. J.Vis.Exp. (100), (2015).
- Jing, X. L., et al. Radiomorphometric quantitative analysis of vasculature utilizing micro-computed tomography and vessel perfusion in the murine mandible. Craniomaxillofac.Trauma Reconstr. 5 (4), 223-230 (2012).
- Melloul, E., et al. Small animal magnetic resonance imaging: an efficient tool to assess liver volume and intrahepatic vascular anatomy. J.Surg.Res. 187 (2), 458-465 (2014).
- Schwier, M., Bohler, T., Hahn, H. K., Dahmen, U., Dirsch, O. Registration of histological whole slide images guided by vessel structures. J.Pathol.Inform. 4 ((Suppl)), 10 (2013).
- Selle, D., Preim, B., Schenk, A., Peitgen, H. O. Analysis of vasculature for liver surgical planning. IEEE Trans.Med.Imaging. 21 (11), 1344-1357 (2002).
- Shergill, U., et al. Inhibition of of VEGF- and NO-dependent angiogenesis does not impair liver regeneration. Am.J.Physiol Regul.Integr.Comp Physiol. 298 (5), 1279-1287 (2010).
- Sueyoshi, R., Ralls, M. W., Teitelbaum, D. H. Glucagon-like peptide 2 increases efficacy of distraction enterogenesis. J.Surg.Res. 184 (1), 365-373 (2013).
- Wei, W., et al. Rodent models and imaging techniques to study liver regeneration. Eur.Surg.Res. 54 (3-4), 97-113 (2015).
- Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. J.Vis.Exp. (92), e51955 (2014).
