Visualisering av Vascular och parenkymal Regeneration efter 70% partiell hepatektomi hos normala möss
Summary
Tools used for visualizing vascular regeneration require methods for contrasting the vascular trees. This film demonstrated a delicate injection technique used to achieve optimal contrasting of the vascular trees and illustrate the potential benefits resulting from a detailed analysis of the resulting specimen using µCT and histological serial sections.
Abstract
En modifierad silikon injektionsproceduren användes för visualisering av lever vaskulära trädet. Detta förfarande bestod av in-vivo injektion av silikonföreningen, via en 26 G kateter, till den portala eller lever ven. Efter silikon injektion var organ explanterades och förberedd för ex vivo mikro CT (μCT) skanning. Silikoninjektionsproceduren är tekniskt utmanande. Uppnå ett framgångsrikt resultat kräver omfattande mikro erfarenhet från kirurgen. En av utmaningarna i detta förfarande innebär att bestämma lämplig perfusionshastighet för silikonförening. Den perfusionshastighet för silikonföreningen måste definieras baserat på den hemodynamiska av det vaskulära systemet av intresse. Olämplig perfusionshastighet kan leda till en ofullständig perfusion, artificiell dilatation och bristning av vaskulära träd.
3D-rekonstruktion av kärlsystemet baserades på datortomografi och uppnåddes med hjälp avpreklinisk program som HepaVision. Kvaliteten på det rekonstruerade vaskulära trädet var direkt relaterad till kvaliteten på silikon perfusion. Därefter beräknade vaskulära parametrar för kärltillväxt, såsom total kärlvolymen, beräknades baserat på kärlrekonstruktioner. Kontrasterande det vaskulära trädet med silikon tillåtet för efterföljande histologisk upparbetning av provet efter μCT skanning. Provet kan utsättas för seriesnitt, histologisk analys och hela diabilder, och därefter till 3D-rekonstruktion av kärl träd baserade på histologiska bilder. Detta är en förutsättning för detektion av molekylära händelser och deras fördelning i förhållande till det vaskulära trädet. Denna modifierade silikon injektionsproceduren kan också användas för att visualisera och rekonstruera kärlsystem i andra organ. Denna teknik har potential att användas i stor utsträckning studier om vaskulära anatomin och tillväxt i olika djur enND sjukdomsmodeller.
Introduction
Leverregenerering bestäms ofta genom att mäta ökningen av levervikten och volymen och genom att bedöma hepatocytproliferation hastigheten 16. Dock är leverregenerering inte bara inducera parenkymal förnyelse men också vaskulär regeneration 6. Därför bör vaskulär tillväxt undersökas vidare med avseende på dess roll i utvecklingen av leverregenerering. Visualisering av leverkärlsystemet är avgörande för att öka kunskaperna om vaskulär regeneration. Ett stort antal indirekta metoder har utvecklats för att studera de bakomliggande molekylära mekanismerna för lever vaskulär förnyelse. Traditionellt, detektering av cytokiner (vaskulär endotelial tillväxtfaktor, VEGF) 14, kemokiner och deras receptorer (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12) 4 har varit stöttepelaren för att studera vaskulär regenerering. Men skulle en 3D-modell tillsammans med kvantitativ analys av kärl lägga kritiska anatomiskainformation för att få en bättre förståelse för den viktiga relationen mellan parenkymal och vaskulär förnyelse.
För att visualisera den hepatiska kärlsystemet, vilket kräver kontrasterande de vaskulära träd, injicerades möss med en radiopak silikongummi kontrastmedel direkt in i portalen eller lever venös vaskulära trädet. Efter polymerisation av silikon och explantation av organ ades leverprov utsattes för μCT scanning med hjälp av en CT-scanner. Skannar resulterade i voxel bildrepresentationer av silikon injektion prover 9.
För kvalitetskontroll, var kärlsystemet först visualiseras i 3D med hjälp preklinisk programvara. Segmentering utfördes genom att sätta en tröskel mellan den mjuka vävnaden intensitet och fartyget intensitet. Den resulterande fartyg mask synliggjordes med användning ytrendering. Programvaran tillät också för manuell bestämning av två parametrar för vascular tillväxt: maximal fartygets längd och radie.
En preklinisk programvara användes sedan för 3D-rekonstruktion av kärl träd och efterföljande beräkning av leverans eller dränerande vaskulära områden 13. Dessutom har denna mjukvara bestäms automatiskt vissa parametrar i vaskulär tillväxt, såsom den totala längden av alla synliga kärlstrukturer även känd som den totala kantlängden eller den totala kärlvolymen.
Silikon perfusion Förfarandet utfördes på naiva möss och hos möss som undergick 70% partiell hepatektomi (PH). Lever samlades vid olika observations tidpunkter efter resektion för att analysera vaskulär och parenkymal leverregenerering med hjälp av den tidigare nämnda visualisering och kvantifiering teknik.
De viktigaste målen för denna film är att: (1) visar den känsliga injektionsteknik som krävs för att uppnå optimal kontrasterande och (2) visar den potentiella nyttan resulterande frOm en detaljerad analys av de resulterande prov med μCT och histologiska seriesnitt. Efter att ha sett denna film, bör läsaren ha en bättre förståelse för hur man injicerar silikonförening i en specifik kärlsystemet och användbarhet och användbarheten av tekniken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kontrasterande kärlträdet med silikon injektion och μCT scanning har införts i tumörmodeller och neurologiska sjukdomsmodeller ofta för att studera angiogena progression 5,7,8,10. Förbättringar i metoder för silikon injektion gjordes i föreliggande studie för att visualisera och kvantifiera vaskulär tillväxt efter partiell hepatektomi hos möss.
Det finns ett antal kritiska steg som behöver uppmärksamhet för att uppnå god perfusion kvalitet. Först av allt, är sy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding by the German Ministry of Education and Research (BMBF) via the systems biology network “Virtual Liver”, grant numbers 0315743 (ExMI), 0315765 (UK Jena), 0315769 (MEVIS).The authors also thank Frank Schubert for technical support.
Materials
| PERFUSOR® VI | B.BRAUN | 87 222/0 | |
| Pipetus®-akku | Hirschmann | 9907200 | |
| Pipets | Greiner | 606180 | |
| micro scissors | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 14058-09 | |
| micro serrefine | Fine Science Tools (F·S·L) | No.18055-05 | |
| Micro clamps applicator | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 18057-14 | |
| Straight micro forceps | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 00632-11 | |
| Curved micro forceps | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 00649-11 | |
| needle-holder | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 12061-01 | |
| 1ml syringe | B.Braun | 9161406V | |
| 5ml syringe | B.Braun | 4606051V | |
| extension and connection lines | B.Braun | 4256000 | 30cm, inner ø1.2mm |
| 6-0 silk (Perma-Hand Seide) | Ethicon | 639H | |
| 6-0 prolene | Ethicon | 8711H | |
| Microfil® MV diluent | FLOW TECH, INC | ||
| Microfil® MV – 120 | FLOW TECH, INC | MV – 120 (blue) | |
| MV curing agent | FLOW TECH, INC | ||
| Heparin 2500 I.E./5ml | Rotexmedica | ETI3L318-15 | |
| Saline | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | E15117/D DE | |
| Imalytics Preclinical software | Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, Germany | ||
| HepaVision | Fraunhofer MEVIS, Bremen, Germany | ||
| NanoZoomer 2.0-HT Digital slide scanner | Hamamatsu Electronic Press, Japan | C9600 | |
| Tomoscope Duo CT | CT Imaging GmbH, Erlangen, Germany | TomoScope® Synergy | |
References
- Bearden, S. E., Segal, S. S. Neurovascular alignment in adult mouse skeletal muscles. Microcirculation. 12 (2), 161-167 (2005).
- Brown, R. P., Delp, M. D., Lindstedt, S. L., Rhomberg, L. R., Beliles, R. P. Physiological parameter values for physiologically based pharmacokinetic models. Toxicol.Ind.Health. 13 (4), 407-484 (1997).
- Dai, D., et al. Elastase-Induced Intracranial Dolichoectasia Model in Mice. Neurosurgery. , (2015).
- Ding, B. S., et al. Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration. Nature. 468 (7321), 310-315 (2010).
- Downey, C. M., et al. Quantitative ex-vivo micro-computed tomographic imaging of blood vessels and necrotic regions within tumors. PLoS.One. 7 (7), 41685 (2012).
- Ehling, J., et al. CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis. Gut. , (2014).
- Ehling, J., et al. Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization. Am.J.Pathol. 184 (2), 431-441 (2014).
- Ghanavati, S., Yu, L. X., Lerch, J. P., Sled, J. G. A perfusion procedure for imaging of the mouse cerebral vasculature by X-ray micro-CT. J.Neurosci.Methods. 221, 70-77 (2014).
- Gremse, F., et al. Hybrid microCT-FMT imaging and image analysis. J.Vis.Exp. (100), (2015).
- Jing, X. L., et al. Radiomorphometric quantitative analysis of vasculature utilizing micro-computed tomography and vessel perfusion in the murine mandible. Craniomaxillofac.Trauma Reconstr. 5 (4), 223-230 (2012).
- Melloul, E., et al. Small animal magnetic resonance imaging: an efficient tool to assess liver volume and intrahepatic vascular anatomy. J.Surg.Res. 187 (2), 458-465 (2014).
- Schwier, M., Bohler, T., Hahn, H. K., Dahmen, U., Dirsch, O. Registration of histological whole slide images guided by vessel structures. J.Pathol.Inform. 4 ((Suppl)), 10 (2013).
- Selle, D., Preim, B., Schenk, A., Peitgen, H. O. Analysis of vasculature for liver surgical planning. IEEE Trans.Med.Imaging. 21 (11), 1344-1357 (2002).
- Shergill, U., et al. Inhibition of of VEGF- and NO-dependent angiogenesis does not impair liver regeneration. Am.J.Physiol Regul.Integr.Comp Physiol. 298 (5), 1279-1287 (2010).
- Sueyoshi, R., Ralls, M. W., Teitelbaum, D. H. Glucagon-like peptide 2 increases efficacy of distraction enterogenesis. J.Surg.Res. 184 (1), 365-373 (2013).
- Wei, W., et al. Rodent models and imaging techniques to study liver regeneration. Eur.Surg.Res. 54 (3-4), 97-113 (2015).
- Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. J.Vis.Exp. (92), e51955 (2014).
