Murine Hind Gliedmaßen langen Knochen Dissection und Knochenmark-Isolation

Summary

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

Abstract

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Introduction

The study of long bones and the cells of the bone marrow is central to a myriad of research disciplines, including, but not limited to, bone biology, cancer biology, immunology, hematology, and biomechanics. The bone is a highly dynamic organ that together with the cartilage forms the skeleton to provide mechanical support against loading and protection of the internal organs. In addition, the mineral components of bone are a storage sink for the critical signaling molecules calcium and phosphorus, as well as other factors¹. Finally, bones house the bone marrow and, together with metabolically active bone forming osteoblasts and bone resorbing osteoclasts, provide the stem cell niche necessary for the maintenance of hematopoietic and lymphoid cell populations.

Bone and bone marrow are affected in many disorders, often leading to bone marrow dysfunction, severe bone pain, and pathologic fracture. Bone is a common site of metastasis in many solid tumors, most notably breast cancer and prostate cancer, where tumor cells directly engage the bone marrow niche to initiate the vicious cycle of bone metastasis and displace hematopoietic stem cells^2,3. Hematopoietic malignancies including myeloma and leukemia are characterized by bone marrow dysfunction as well as deregulation of healthy bone remodeling¹. Other non-malignant skeletal disorders are also active areas of research, such as osteoarthritis, osteoporosis, scoliosis, and rickets. Even in an otherwise healthy individual, biomechanical failure in a bone leads to a painful fracture. All of these disorders represent active areas of research with the goal of identifying new preventative measures and treatment regimens to reduce morbidity and mortality.

To research the plethora of roles of the bone and the bone marrow, both under physiologic and pathologic conditions, it is critical for researchers to have a simple and efficient standardized method for dissection of the mouse long bones for rapid processing of large in vivo experiments. The dissection protocol outlined here is suitable for all long bone analyses including ex vivo imaging, histology, histomorphometry, and strength testing, among others. Similarly, a standardized bone marrow isolation method with high bone marrow cell recovery and low inter-user variability is important for experimental analysis such as fluorescence-activated cell sorting (FACS) or quantitative PCR (qPCR) as well as downstream applications such as primary cell culture of bone marrow cells.

Protocol

Alle tierischen Arbeit wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee in Übereinstimmung mit den Empfehlungen in dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health skizzierte genehmigt. 1. Hind Gliedmaßen langen Knochen Dissection Euthanize die Maus gemäß den Richtlinien des Instituts. Bewegen Sie die Maus in Rückenlage und bringen durch alle vier Beine durch die Maus Fußballen unter dem Sprunggelenk feststecken. Sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol, gründlich die Beine Begießen. Machen Sie einen kleinen Schnitt auf der rechten Seite der Mittellinie in den Unterbauch, knapp oberhalb der Hüfte. Ziehen Sie den Einschnitt in den Beinen und vorbei am Sprunggelenk. Ziehen Sie die Haut zurück und schneiden Sie die Quadrizeps-Muskel proximalen Ende des Oberschenkelknochens verankert die Vorderseite des Oberschenkels zu entlarven und Stift aus dem Bein aus, um den Stift in einem 45-Grad-Winkel von der Platine platzieren. Mit dem blade der Schere gegen die hintere Seite des Oberschenkels, schneiden Sie die Beinbeuger aus dem Kniegelenk entfernt. Ziehen Sie die Haut zurück, und die hinteren Oberschenkelmuskeln zu proximalen Ende des Oberschenkelknochens verankert die hintere Seite des Oberschenkels zu entlarven und Stift aus dem Bein aus, um den Stift in einem 45-Grad-Winkel von der Platine platzieren. Mit der Zange, halten das distale Ende des Femurs, direkt über dem Kniegelenk. Führen Sie die Klingen der Schere auf beiden Seiten der Femurschaft in Richtung des Hüftgelenks, wobei darauf geachtet, nicht zu schneiden, in den Oberschenkelknochen selbst. Nach dem Hüftkopf zu erreichen, durch die Schere leicht zu öffnen angezeigt, drehen Sie die Schere mit der oberen Klinge der Schere direkt über dem Hüftkopf Bewegen des Oberschenkels zu verrücken, man aufpassen, nicht die Knochen unterhalb des Hüftkopfes zu schnappen. Fassen Sie den oberen Teil des Oberschenkelschaft mit der Zange, schneiden Sie das Weichgewebe aus dem Hüftkopf entfernt es aus der Hüftpfanne zu lösen. Ziehen Sie die gesamte Beinknochen, einschließlichFemur, Knie und Schienbein, nach oben und weg vom Körper, Schneiden sorgfältig das Bindegewebe und Muskulatur verbindet das Bein auf die Haut entfernt. Vorwagt das Sprunggelenk und wieder die Schere in einer Drehbewegung verwenden, um die Tibia zu verrücken. Greifen die distale Ende der Tibia, dabei nicht die Sehnen zu trennen, ziehen Sie die Tibia nach oben und weg vom Körper und dem Stift Bord. Schneiden jegliches verbleibende Bindegewebe den langen Knochen am Knie an der Maus befestigt. Entfernen Sie alle zusätzlichen Muskel oder Binde am Femur befestigt Gewebe und der Tibia. Für alle Anwendungen , die den Knochen erfordern intakt (Histologie, Histomorphometrie, biomechanische Tests, etc.) Zu bleiben, mit Standard-Haus Protokolle (wie in 4-7) um fortzufahren. Um Knochenmark zu isolieren, gehen Sie zu Abschnitt 2. 2. Lange Knochenpräparation für Knochenmark-Isolation Mit Hilfe der Pinzette fassen Sie den Oberschenkelknochen mit der Patella abgewandten einnd das proximale Ende (Hüftkopf) nach unten. Vorwagt, das Kniegelenk und die Schere in einer Drehbewegung der Tibia zu verrücken und Femur. Schneiden Sie Bindegewebe zusammen, um den Oberschenkel und Schienbein zu halten. Mit Hilfe der Pinzette fassen Sie den Oberschenkelknochen mit dem vorderen abgewandten Seite und dem proximalen Ende (Hüftkopf Ende) nach unten. Führen Sie die Schere, um die Femurschaft zu den Kondylen nach oben. Vorsichtig drehen die Schere hin und her die Kondylen, die Patella zu entfernen, und die Epiphyse die Metaphyse zu belichten. Entfernen Sie alle zusätzlichen Muskel oder Binde am Femur befestigt Gewebe mit einer Pinzette, Schere und Kimwipes. Mit Hilfe der Pinzette greifen die Tibia mit der vorderen Seite abgewandten und dem distalen Ende (Knöchel Ende) nach unten. Wenn die Tibiaepiphyse intakt ist, führen die Schere der Tibia Welle auf die Kondylen. Drehen Sie vorsichtig die Schere hin und her die Kondylen zu entfernen und Epiphyse die Metaph aussetzenlyse. Entfernen Sie alle Muskeln oder Binde an der Tibia befestigt Gewebe mit einer Pinzette, Schere und Kimwipes. 3. Bone Marrow Isolation Drücken eine 18 G Nadel durch den Boden eines 0,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Legen Sie die langen Knochen (maximal 2 Oberschenkel- und 2 tibiae) in das Rohr, Knie-Ende nach unten am Ende nach unten und den Deckel schließen. Nest der 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugiere die Röhrchen bei nested ≥10,000 xg in einer Mikrozentrifuge für 15 Sekunden. Stellen Sie sicher, dass das Knochenmark wurde aus den Knochen durch visuelle Inspektion gesponnen worden. Die Knochen sollte erscheinen weiß und es sollte eine große visuelle Pellet in dem größeren Rohr sein. Entsorgen Sie die 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit den Knochen. Hängen Sie das Knochenmark in geeigneten Lösung (zB PBS, Kulturmedien, FACS – Puffer) und fahren Sie mit experimentellen Protokoll (DNA, RNA oder Proteinisolierung,FACS-Analyse oder primäre Zellkultur).

Representative Results

Das hier beschriebene Protokoll ist für eine schnelle Präparation der Maus Femur und Tibia mit einem Minimum an Beschädigung des Knochengewebes optimiert. Diese Technik ist für eine Anzahl von Downstream – Analysen geeignet, einschließlich Biomechanik Studien Histomorphometrie (1A – B) und Histologie (1C) 4,7. Der Vertreter histomophometric micoCT 3D – Rekonstruktion (1A – B) zeigt , dass sowohl die Spongiosa und kortikalen Schale aufrechterhalten werden, die für eine genaue Quantifizierung der standardisierten Strukturparameter für Knochenhistomorphometrie ermöglicht, einschließlich trabekulären Anzahl, Dicke und Beabstandung; Knochenvolumen; und kortikalen Dicke unter anderem Maßnahmen 8. Der Vertreter histologischen Schnitt zeigt eine H & E – gefärbten Formalin-fixierten und entkalkt Tibia (1C). Das Bild zeigt die Integrität sowohl des verkalkten bein und zelluläre Knochenmark für die histologische Analyse. Das Knochenmark Isolierungsverfahren bewahrt die Sterilität des Knochenmarks Raum, hat eine geringe Handhabung Kontamination zu reduzieren, und nicht das Schneiden des langen Knochens erfordert, wodurch Verlust von Knochenmark-Ausbeute. Das Knochenmark ist geeignet für viele Downstream – Anwendungen, einschließlich Durchflusszytometrie 5 und PCR – Analysen. Darüber hinaus kann dieses Verfahren verwendet werden , um Knochenmark für die primäre Zellkultur von Knochenmarkzellen zu isolieren, einschließlich der Osteoklasten und Osteoblasten (2A – B) 4,6. Abbildung 1. Histomorphologische und histologische Analysen der Maus langen Knochen. Dreidimensionale microCT Rekonstruktion einer Maus Tibia (A) , um die äußere Rindenschale zeigt und (B </s trong>) Spongiosa (Maßstab = 0,5 mm). (C) Histologische H & E-Färbung eines entkalkt und schnittene Tibia (4x). Bilder mit freundlicher Genehmigung von Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, USA. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 2. Primäre Knochenmarkzellkultur für die Differenzierung von Osteoklasten und Osteoblasten. (A) TRAP – Färbung für mehrkernige Osteoklasten nach 7 Tagen in osteoclastogenic Medien (4x). (B) Die alkalische Phosphatase (violette Farbe) für Osteoblasten und Alizarin rot (rote Farbe) Fleck für die Mineralisierung nach 21 Tagen in osteogenen Medien. Bilder mit freundlicher Genehmigung von Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, USA.iles / ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

We present a simple and efficient method for removal of mouse hind long bones and subsequent bone marrow isolation. This method maintains the high structural and cellular integrity of the bones and bone marrow and has low handling time, minimizing the likelihood of user-induced fracture or bone scoring that may influence downstream analyses. In addition, the centrifugation method for isolating bone marrow does not require cutting the bone to expose the bone marrow space or fluid to flush the bone marrow, reducing potential points of contamination. Moreover, the centrifuge technique is relatively high-throughput with lower hands-on time than other methods, thus reducing processing time.

High variation is inherent to in vivo mouse studies due to high mouse-to-mouse phenotypic variation. In order to maximize the research impact of expensive and labor-intensive mouse studies, it is critical to minimize technical experimental error^9,10. Time from animal sacrifice to downstream analysis or tissue fixation introduces experimental variation that may overcome subtle changes and reduce large differences between groups. Therefore, rapid processing of samples is essential for accurate data analysis. The long bone dissection and bone marrow isolation techniques described here are optimized for rapid processing of animals and samples to reduce technical variation.

This protocol can be widely applied to many research fields, including investigation of the bone tissue itself or interrogation of the cells of the bone marrow. In addition, this straightforward approach to long bone dissection will enable researchers in related fields to directly interrogate bone contributions in order to expand our knowledge of bone marrow dysfunction in otherwise understudied pathologies.

Materials

pinboard
pins
70% ethanol
dissection sissors
dissection forceps
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120
16 guage needle
1.5 ml microcentrifuge tube
0.5 ml microcentrifuge tube
microcentrifuge