Murino arto posteriore osso lungo dissezione e isolamento di midollo osseo

Summary

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

Abstract

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Introduction

The study of long bones and the cells of the bone marrow is central to a myriad of research disciplines, including, but not limited to, bone biology, cancer biology, immunology, hematology, and biomechanics. The bone is a highly dynamic organ that together with the cartilage forms the skeleton to provide mechanical support against loading and protection of the internal organs. In addition, the mineral components of bone are a storage sink for the critical signaling molecules calcium and phosphorus, as well as other factors¹. Finally, bones house the bone marrow and, together with metabolically active bone forming osteoblasts and bone resorbing osteoclasts, provide the stem cell niche necessary for the maintenance of hematopoietic and lymphoid cell populations.

Bone and bone marrow are affected in many disorders, often leading to bone marrow dysfunction, severe bone pain, and pathologic fracture. Bone is a common site of metastasis in many solid tumors, most notably breast cancer and prostate cancer, where tumor cells directly engage the bone marrow niche to initiate the vicious cycle of bone metastasis and displace hematopoietic stem cells^2,3. Hematopoietic malignancies including myeloma and leukemia are characterized by bone marrow dysfunction as well as deregulation of healthy bone remodeling¹. Other non-malignant skeletal disorders are also active areas of research, such as osteoarthritis, osteoporosis, scoliosis, and rickets. Even in an otherwise healthy individual, biomechanical failure in a bone leads to a painful fracture. All of these disorders represent active areas of research with the goal of identifying new preventative measures and treatment regimens to reduce morbidity and mortality.

To research the plethora of roles of the bone and the bone marrow, both under physiologic and pathologic conditions, it is critical for researchers to have a simple and efficient standardized method for dissection of the mouse long bones for rapid processing of large in vivo experiments. The dissection protocol outlined here is suitable for all long bone analyses including ex vivo imaging, histology, histomorphometry, and strength testing, among others. Similarly, a standardized bone marrow isolation method with high bone marrow cell recovery and low inter-user variability is important for experimental analysis such as fluorescence-activated cell sorting (FACS) or quantitative PCR (qPCR) as well as downstream applications such as primary cell culture of bone marrow cells.

Protocol

Tutto il lavoro animale è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa in conformità con le raccomandazioni delineate nella guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. La dissezione 1. arto posteriore delle ossa lunghe Euthanize il mouse in conformità con le linee guida istituzionali. Posizionare il mouse in posizione supina e apporre da appuntare tutte e quattro le gambe attraverso le pastiglie del mouse zampa sotto l'articolazione della caviglia. Spruzzare il mouse con il 70% di etanolo, accuratamente dousing le gambe. Fai una piccola incisione a destra di linea mediana nel basso addome, appena sopra l'anca. Estendere l'incisione lungo la gamba e oltre la caviglia. Tirare indietro la pelle e tagliare il muscolo quadricipite ancorato all'estremità prossimale del femore per esporre il lato anteriore del femore e il pin out dalla gamba, posizionando il perno con un angolo di 45 gradi dalla scheda. Con la fogliae delle forbici contro il lato posteriore del femore, tagliare i femorali dal ginocchio. Tirare indietro la pelle ed i muscoli adduttori ancorati alla estremità prossimale del femore per esporre il lato posteriore del femore e il pin dalla gamba, mettendo il perno in un angolo di 45 gradi dalla scheda. Con la pinza, tenere l'estremità distale del femore, appena sopra il ginocchio. Guida lame delle forbici su entrambi i lati del femore verso l'anca, facendo attenzione a non tagliare nel femore stesso. Dopo aver raggiunto la testa del femore, indicato dalle forbici apertura leggermente, ruotare le forbici con lama superiore delle forbici muovono direttamente sopra la testa femorale di dislocare femore, facendo attenzione a non scattare l'osso sotto della testa femorale. Afferrare la parte superiore del femore con la pinza, tagliare il tessuto molle dalla testa del femore per liberarla dal dell'acetabolo. Estrarre l'intero osso della gamba, tra cuifemore, ginocchio e tibia, alto e lontano dal corpo, accuratamente tagliando via il tessuto connettivo e muscolare che collega la gamba alla pelle. Sovraccaricare l'articolazione della caviglia e di nuovo usare le forbici in un movimento rotatorio di dislocare la tibia. Afferrando l'estremità distale della tibia, facendo attenzione a non recidere i tendini, tirare la tibia alto e lontano dal corpo e la lavagna. Tagliare qualsiasi tessuto connettivo restante fissaggio del osso lungo al mouse al ginocchio. Rimuovere qualsiasi muscolo supplementare o tessuto connettivo attaccata al femore e la tibia. Per tutte le applicazioni che richiedono l'osso di mantenere intatte (istologia, istomorfometria, test biomeccanico, ecc.), Procedere con protocolli standard in-house (come nel 4-7). Per isolare il midollo osseo, passare alla sezione 2. 2. Preparazione delle ossa lunghe per isolamento di midollo osseo Utilizzando le pinze, afferrare il femore con la rotula rivolto verso unND l'estremità prossimale (testa del femore) verso il basso. Sovraccaricare l'articolazione del ginocchio e usare le forbici in un movimento rotatorio di dislocare la tibia e il femore. Tagliare qualsiasi tessuto connettivo che tiene il femore e tibia insieme. Utilizzando le pinze, afferrare il femore con il lato anteriore rivolto verso e l'estremità prossimale (lato testa del femore) verso il basso. Guida le forbici la diafisi femorale ai condili. Delicatamente ruotare le forbici avanti e indietro per rimuovere i condili, rotula, e l'epifisi per esporre metafisi. Rimuovere ogni muscolo supplementare o del tessuto connettivo attaccato al femore usando pinze, forbici, e Kimwipes. Utilizzando le pinze, afferrare la tibia con il lato anteriore rivolto verso e l'estremità distale (fine caviglia) verso il basso. Se l'epifisi tibiale è intatto, guidare le forbici il pozzo tibia ai condili. Delicatamente ruotare le forbici avanti e indietro per rimuovere i condili e dell'epifisi per esporre la MetYsis. Rimuovere ogni muscolo supplementare o del tessuto connettivo attaccato alla tibia usando pinze, forbici, e Kimwipes. Isolamento 3. midollo osseo Inserire un ago G 18 attraverso il fondo di un tubo di 0,5 ml microcentrifuga. Posizionare le ossa lunghe (massimo 2 femori e tibie 2) nel tubo, ginocchio-end verso il basso end verso il basso e chiudere il coperchio. Nest il tubo di 0,5 ml microcentrifuga in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Centrifugare le provette annidati a ≥10,000 xg in una microcentrifuga per 15 sec. Verificare che il midollo osseo è stata filata su ossa mediante ispezione visiva. Le ossa dovrebbero apparire bianco e ci dovrebbe essere una grande pellet visivo nel tubo più grande. Scartare il tubo di 0,5 ml microcentrifuga con le ossa. Sospendere il midollo osseo in soluzione appropriata (ad esempio, PBS, terreni di coltura, di buffer FACS) e procedere con il protocollo sperimentale (DNA, RNA, o isolamento delle proteine,analisi FACS, o colture cellulari primarie).

Representative Results

Il protocollo qui descritto è ottimizzato per una rapida dissezione del femore e della tibia del mouse con un minimo di danni al tessuto osseo. Questa tecnica è adatta per un numero di analisi a valle, compresi gli studi biomeccanica, istomorfometria (Figura 1A – B), e l'istologia (Figura 1C) 4,7. Il histomophometric rappresentante ricostruzione micoCT 3D (Figura 1A – B) dimostra che sia l'osso spongioso e corticale guscio sono mantenuti che consente la precisa quantificazione dei parametri strutturali standardizzate per Istomorfometria ossa, compreso il numero trabecolare, lo spessore e la spaziatura; volume osseo; e lo spessore corticale, tra le altre misure 8. La sezione istologica mostra un rappresentante fissati in formalina e decalcificata tibia H & E macchiato (Figura 1C). L'immagine dimostra l'integrità sia del calcificata buno e del midollo osseo cellulari per l'analisi istologica. La procedura di midollo osseo isolamento conserva la sterilità dello spazio midollare, ha bassa movimentazione per ridurre la contaminazione, e non richiede il taglio del osso lungo, riducendo così la perdita di resa midollo osseo. Questo midollo osseo è adatta a molte applicazioni a valle, tra cui citometria a flusso 5 e PCR analisi. Inoltre, questa procedura può essere utilizzata per isolare midollo osseo per colture primarie di cellule di midollo osseo, tra osteoclasti e osteoblasti (Figura 2A – B) 4,6. Figura 1. istomorfologiche e analisi istologiche di mouse osso lungo. Ricostruzione microCT tridimensionale di una tibia del mouse mostrando (A) il guscio corticale esterno e (B </s Trong>) dell'osso trabecolare (scala bar = 0,5 mm). (C) istologico H & E macchia di una tibia decalcificata e sezionato (4x). Immagini per gentile concessione di Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, Stati Uniti d'America. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 2. primaria midollo osseo coltura cellulare per la differenziazione degli osteoclasti e gli osteoblasti. Colorazione (A) trappola per osteoclasti multinucleate dopo 7 giorni in mezzi osteoclastogenico (4x). (B) La fosfatasi alcalina (colore viola) per osteoblasti e alizarin rosso (colore rosso) della macchia per la mineralizzazione dopo 21 giorni di mezzi osteogenico. Immagini per gentile concessione di Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, Stati Uniti d'America.iles / ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

We present a simple and efficient method for removal of mouse hind long bones and subsequent bone marrow isolation. This method maintains the high structural and cellular integrity of the bones and bone marrow and has low handling time, minimizing the likelihood of user-induced fracture or bone scoring that may influence downstream analyses. In addition, the centrifugation method for isolating bone marrow does not require cutting the bone to expose the bone marrow space or fluid to flush the bone marrow, reducing potential points of contamination. Moreover, the centrifuge technique is relatively high-throughput with lower hands-on time than other methods, thus reducing processing time.

High variation is inherent to in vivo mouse studies due to high mouse-to-mouse phenotypic variation. In order to maximize the research impact of expensive and labor-intensive mouse studies, it is critical to minimize technical experimental error^9,10. Time from animal sacrifice to downstream analysis or tissue fixation introduces experimental variation that may overcome subtle changes and reduce large differences between groups. Therefore, rapid processing of samples is essential for accurate data analysis. The long bone dissection and bone marrow isolation techniques described here are optimized for rapid processing of animals and samples to reduce technical variation.

This protocol can be widely applied to many research fields, including investigation of the bone tissue itself or interrogation of the cells of the bone marrow. In addition, this straightforward approach to long bone dissection will enable researchers in related fields to directly interrogate bone contributions in order to expand our knowledge of bone marrow dysfunction in otherwise understudied pathologies.

Materials

pinboard
pins
70% ethanol
dissection sissors
dissection forceps
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120
16 guage needle
1.5 ml microcentrifuge tube
0.5 ml microcentrifuge tube
microcentrifuge