हम -16 rRNA जीन amplicon अनुक्रमण का उपयोग बैक्टीरियल समुदायों के लक्षण वर्णन के लिए swabs से न्यूक्लिक एसिड निकालने के लिए एक कुशल, मजबूत, और लागत प्रभावी विधि का वर्णन है। विधि कई प्रकार नमूना के लिए एक आम प्रसंस्करण दृष्टिकोण के लिए अनुमति देता है और नीचे की ओर विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं के एक नंबर रह सकते हैं।
वहाँ मानव स्वास्थ्य और रोग के महत्वपूर्ण modulators के रूप में माइक्रोबियल समुदायों की भूमिका के लिए एक से बढ़ सराहना की है। उच्च throughput अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों स्रोतों की विविधता से -16 rRNA जीन अनुक्रमण का उपयोग बैक्टीरियल समुदायों के तेजी से और कुशल लक्षण वर्णन के लिए की अनुमति दी है। हालांकि -16 rRNA अनुक्रम विश्लेषण के लिए आसानी से उपलब्ध उपकरण मानकीकृत वर्कफ़्लोज़ कम्प्यूटेशनल है, डीएनए निष्कर्षण के लिए नमूना प्रसंस्करण अध्ययनों में परिवर्तनशीलता का एक निरंतर स्रोत बनी हुई है। यहाँ हम swabs से न्यूक्लिक एसिड को निकालने के लिए एक कुशल, मजबूत, और लागत प्रभावी विधि का वर्णन है। हम यह भी -16 rRNA जीन अनुक्रमण के लिए नीचे की ओर तरीकों, अनुक्रमण पुस्तकालयों की पीढ़ी, डेटा की गुणवत्ता नियंत्रण, और अनुक्रम विश्लेषण सहित चित्रित करना। कार्यप्रवाह मल और शारीरिक स्थानों और मेजबान प्रजाति की एक किस्म से एकत्र swabs सहित कई नमूने प्रकार, समायोजित कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, डीएनए और आरएनए बरामद अलग कर दिया और इस्तेमाल किया जा सकतापूरे जीनोम अनुक्रमण या शाही सेना seq सहित अन्य अनुप्रयोगों के लिए। विधि वर्णित कई प्रकार नमूना के लिए एक आम प्रसंस्करण दृष्टिकोण लिए अनुमति देता है और, जीनोमिक metagenomic और जानकारी ट्रांसक्रिप्शनल के बहाव के विश्लेषण रह सकते हैं।
मानव कम प्रजनन पथ, गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल प्रणाली, श्वसन तंत्र, त्वचा और जटिल बैक्टीरियल समुदायों कि ऊतक homeostasis को बनाए रखने और मेजबान 1 के स्वास्थ्य के समर्थन के लिए महत्वपूर्ण हैं द्वारा उपनिवेश रहे हैं। उदाहरण के लिए, कुछ lactobacilli योनि तिजोरी को अम्लीय, रोगाणुरोधी प्रभावोत्पादक उत्पादक और स्थानीय मेजबान प्रतिरक्षा को 2-4 नियमन से रोगजनकों के लिए एक दुर्गम वातावरण बना सकते हैं। बैक्टीरियल Microbiome के महत्व के लिए बढ़ती सराहना भी कई नैदानिक संदर्भों में बैक्टीरियल समुदायों निस्र्पक में दिलचस्पी बढ़ गई है। यहाँ हम जननांग के फाहे से बैक्टीरियल Microbiome की संरचना का निर्धारण करने के लिए एक विधि का वर्णन। प्रोटोकॉल आसानी से मल के नमूने और swabs अन्य संरचनात्मक स्थानों और अन्य मेजबान प्रजातियों से एकत्र करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।
नमूनों की संख्या में निहित सीमाओं एकत्र किया जा सकता है कि और संग्रहीत एक दिया संवर्धन से के कारणY भागीदार, इस प्रोटोकॉल एक अनुकूलित फिनोल के क्लोरोफॉर्म आधारित मनका पिटाई विधि 5,6 उपयोग कर एक ही झाड़ू से डीएनए, आरएनए और संभवतः भी प्रोटीन निकालने के लिए डिजाइन किया गया था। मनका पिटाई और डिटर्जेंट के साथ रासायनिक विघटन के साथ बैक्टीरिया कोशिका दीवारों के भौतिक व्यवधान के संयोजन अतिरिक्त enzymatic पाचन कदम के बिना, ग्राम पॉजिटिव ग्राम नकारात्मक, और एसिड फास्ट बैक्टीरिया के तेजी से सेल की अनुमति देता है। उच्च गुणवत्ता शाही सेना को प्राप्त करने के लिए, यह सूखा swabs कि कम या 4 डिग्री से नीचे रखा गया था इस्तेमाल की सिफारिश की है सी तुरंत संग्रह के बाद और -80 डिग्री सेल्सियस पर प्रयोगशाला (यदि लागू हो) के लिए परिवहन, और संग्रहीत लंबी अवधि के दौरान।
किसी नमूने के भीतर बैक्टीरियल Microbiome निर्धारित करने के लिए, इस प्रक्रिया -16 rRNA जीन amplicon अनुक्रमण, जो वर्तमान में सबसे अधिक लागत प्रभावी साधन व्यापक बैक्टीरियल वर्गीकरण आवंटित करने और रिश्तेदार मात्रा का ठहराव प्रदर्शन करना है इस्तेमाल करता है। वैकल्पिक तरीकों qPCR 7 लक्षित शामिल हैं, कस्टम microarrays 8, और पूरे जीनोम अनुक्रमण 9। -16 RRNA जीन नौ hypervariable क्षेत्रों में शामिल है, और वहाँ कोई इष्टतम वी क्षेत्र के बारे में योनि Microbiome अध्ययन के लिए अनुक्रम करने के लिए आम सहमति है। यहाँ हम 515F / 806R प्राइमर सेट का उपयोग करें और Càpòràsò एट अल। 10-12 द्वारा डिजाइन पाइप लाइन पर निर्माण। Càpòràsò एट अल। 'S 515F / 806R प्राइमर सेट मान्य बारकोड वाले प्राइमरों और Illumina अनुक्रमण प्लेटफार्म के साथ संगतता के हजारों की उपलब्धता के कारण एक भी अनुक्रमण रन पर नमूने के सैकड़ों बहुसंकेतन सक्षम बनाता है। विपरीत मानव Microbiome परियोजना के 27F / 338R प्राइमर 13 सेट, 515F / 806R भी प्रभावी ढंग से Bifidobacteriaceae amplifies और इस तरह सही गर्द्नेरेल्ला वेजिनेलिस, कुछ महिलाओं में योनि माइक्रोबियल समुदाय का एक महत्वपूर्ण सदस्य कब्जा। वैकल्पिक रूप से, एक 338F / 806R प्राइमर जोड़ी सफलतापूर्वक योनि नमूनों 14 और 515F / 926R प्राइमर जोड़ी rece है की pyrosequencing के लिए इस्तेमाल किया गया हैntly अगली पीढ़ी के अनुक्रमण 12 के लिए उपलब्ध हो गया है।
अंतत: इस प्रोटोकॉल माइक्रोबियल पारिस्थितिकीय (QIIME) सॉफ्टवेयर पैकेज 15 में मात्रात्मक amplicon इनसाइट्स का उपयोग कर -16 विश्लेषण करने के लिए बुनियादी निर्देश प्रदान करता है। यहाँ वर्णित QIIME आदेशों के सफल क्रियान्वयन के लिए प्रत्येक नमूना बैक्टीरियल वर्गीकरण प्रचुरता से युक्त एक मेज पैदावार। QIIME वेबसाइट पर विस्तार से वर्णित के रूप में कई अतिरिक्त गुणवत्ता नियंत्रण कदम, वर्गीकरण विधियों, और विश्लेषण कदम, विश्लेषण में शामिल किया जा सकता है (http://qiime.org/index.html)। विश्लेषण एक एप्पल कंप्यूटर पर प्रदर्शन किया जाएगा, तो MacQIIME पैकेज 16 QIIME और इसकी निर्भरता की आसान स्थापना प्रदान करता है। -16 RRNA जीन अनुक्रम विश्लेषण के लिए वैकल्पिक सॉफ्टवेयर संकुल Mothur 17 और 18 UPARSE शामिल हैं।
यहाँ हम एक मानव योनि झाड़ू के भीतर पहचान और रिश्तेदार बैक्टीरियल प्रचुरता के लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल आसानी से इस तरह मल के रूप में अन्य प्रकार नमूना, और शरीर के अन्य साइटों के फाहे, के लिए और सूत्रों की एक विस्तृत विविधता से एकत्र नमूनों लिए अनुकूलित किया जा सकता है। मनका पिटाई से न्यूक्लिक एसिड की निकासी फिनोल और क्लोरोफॉर्म की एक बफर समाधान में दोनों डीएनए और आरएनए, जो विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जब नैदानिक अध्ययन के माध्यम से एकत्र कीमती नमूनों के साथ काम करने का अलगाव के लिए अनुमति देता है। पृथक जीवाणु के डीएनए, जीवाणु वर्गीकरण पहचान और जीनोमिक विधानसभा के लिए उत्कृष्ट है, जबकि शाही सेना के एक साथ शाही सेना संग्रह seq के माध्यम से कार्यात्मक बैक्टीरियल, मेजबान, और वायरल योगदान निर्धारित करने का अवसर प्रदान करता है। वर्णित प्रोटोकॉल एक से मान्य एक कदम प्राइमर का गठन किया है कि सफलतापूर्वक मानवीय, कुत्ते सहित नमूना प्रकार की एक विस्तृत श्रृंखला पर तैनात किया गया है, और पर्यावरण के नमूने 10 का उपयोग करता है </sup>। बारकोड वाले प्राइमरों के हजारों की उपलब्धता अनुक्रमण लागत पर नमूने और भारी बचत की बहुसंकेतन सक्षम बनाता है। पूरी लागत (सभी अभिकर्मकों, एक एकल अनुक्रमण रन, और प्राइमरों नहीं बल्कि उपकरणों सहित) नमूना प्रति के बारे में $ 20 जब 200 नमूने मल्टिप्लेक्स रहे हैं। इसके अतिरिक्त, वहाँ बहुत उच्च reproducibility जब एक ही नमूना साइट से कई swabs पूरे पाइप लाइन के माध्यम से स्वतंत्र रूप से कार्रवाई कर रहे हैं। कुल मिलाकर, प्रोटोकॉल, कुशल लचीला, विश्वसनीय, और repeatable खर्च किया जाता है।
इस प्रोटोकॉल के न्यूक्लिक एसिड निकासी हिस्से जब फिनोल और क्लोरोफॉर्म के साथ काम करने के लिए आवश्यक सुरक्षा सावधानियों, और एक उच्च throughput, 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप करने के लिए पाइप लाइन को स्वचालित करने की चुनौतियों से सीमित है। इसके अतिरिक्त, जोरदार पिटाई मनका लगभग 6 kilobase टुकड़े करने के लिए यांत्रिक सेल कैंची के लिए इस्तेमाल किया जीवाणु के डीएनए; अब डीएनए टुकड़े बहाव के अनुप्रयोगों, मनका पिटाई एस के अवधि के लिए आवश्यक हैंHould छोटा हो। इस प्रोटोकॉल के जीवाणु पहचान हिस्से की सीमाओं के किसी भी विधि है कि -16 rRNA जीन अनुक्रमण पर निर्भर करता है के लिए निहित हैं। -16 RRNA अनुक्रमण जीनस और यहां तक कि प्रजातियों के स्तर को जीवाणु पहचान लिए आदर्श है, लेकिन शायद ही कभी तनाव के स्तर की पहचान प्रदान करता है। -16 RRNA जीन की V4 चर क्षेत्र सबसे बैक्टीरियल प्रजातियों 11 के बीच मजबूत भेदभाव प्रदान करता है, इस तरह के Oligotyping 31 के रूप में अतिरिक्त कम्प्यूटेशनल विधियों ठीक ऐसी लैक्टोबैसिलस crispatus के रूप में कुछ प्रजातियों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा करना पड़ सकता है। अंत में, एक विशेष नमूना भीतर सटीक बैक्टीरियल कार्य क्षमताओं के बारे में जानकारी -16 rRNA जीन अनुक्रमण द्वारा अकेले निर्धारित नहीं किया जा सकता है, हालांकि इस प्रोटोकॉल के पूरे जीनोम डीएनए और आरएनए कि इस उद्देश्य की दिशा में इस्तेमाल किया जा सकता की निकासी के लिए सक्षम बनाता है।
इस प्रोटोकॉल के साथ सफलता सुनिश्चित करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम बड़ी सावधानी संदूषण dur को रोकने के लिए ले जा रहा हैआईएनजी नमूना संग्रह, न्यूक्लिक एसिड निकासी, और पीसीआर प्रवर्धन। स्वच्छ दस्ताने पहने और बाँझ swabs, ट्यूब, और कैंची का उपयोग करके नमूना संग्रह के बार में बाँझपन सुनिश्चित करें। संग्रह सामग्री के प्रदूषण के लिए आकलन करने के लिए, नमूने के समय परिवहन ट्यूबों में सीधे अतिरिक्त अप्रयुक्त swabs रखकर नकारात्मक नियंत्रण के फाहे इकट्ठा। प्रयोगशाला में, केवल decontaminated आपूर्ति युक्त और केवल आणविक ग्रेड, डीएनए से मुक्त अभिकर्मकों का उपयोग कर एक निष्फल हुड में सभी पूर्व प्रवर्धन चरणों का प्रदर्शन। न्यूक्लिक एसिड निकासी के दौरान, सभी ट्यूबों जब तक उपयोग में बंद कर प्रत्येक नमूने के साथ नया बाँझ संदंश और ताजा दस्ताने का उपयोग कर, और रखकर पार प्रदूषण को रोकने के। समानांतर में अप्रयुक्त swabs प्रसंस्करण दोनों नमूना संग्रह और न्यूक्लिक एसिड निकासी के बाँझपन सुनिश्चित करता है; अप्रयुक्त swabs isopropanol वर्षा और इथेनॉल धोने के बाद एक गोली उपज नहीं करना चाहिए। एक गोली दिखाई देता है, का एक संभावित स्रोत का निर्धारण करने के लिए प्रदर्शन -16 rRNA जीन प्रवर्धनसंदूषण (जैसे, स्ट्रेप्टोकोकस या Staphylococcus की उपस्थिति त्वचा संदूषण का संकेत होता)। इसके अतिरिक्त, यह सुनिश्चित करें कि पीसीआर अभिकर्मकों और प्रतिक्रियाओं दूषित नहीं किया गया है समानांतर में कोई टेम्पलेट नियंत्रण प्रतिक्रियाओं के साथ पीसीआर amplifications प्रदर्शन करते हैं। एक बैंड एक नहीं टेम्पलेट नियंत्रण में प्रकट होता है, अभिकर्मकों त्यागने और ताजा अभिकर्मकों के साथ प्रवर्धन दोहराएँ। इन सावधानियों ले रहा है हित के बैक्टीरिया के सफल अनुक्रमण सुनिश्चित करेगा।
पीसीआर प्रवर्धन कदम सबसे समस्या निवारण की आवश्यकता के लिए जाता है। बारह नमूने के सेट में amplifying दक्षता और स्थिरता के बीच एक संतुलन प्रदान करता है। एक दिया प्रवर्धन सेट में सभी नमूने भर में बैंड का पूर्ण अभाव एक व्यवस्थित विफलता को इंगित करता है, उदाहरण के लिए, एक अभिकर्मक जोड़ने की भूल या गलत तरीके से thermocycler प्रोग्रामिंग। कुछ नमूनों से एक बैंड के अभाव में आम तौर पर मानव त्रुटि के कारण है, और amplifications फिर से आर किया जाना चाहिएनमूना और रिवर्स प्राइमर का एक ही बाँधना के साथ संयुक्त राष्ट्र। एक बैंड के निरंतर अभाव के मामले में, नमूना एक अलग बारकोड के साथ एक रिवर्स प्राइमर का उपयोग फिर से परिलक्षित किया जा सकता है। कई रिवर्स प्राइमरों के साथ दोहराया प्रवर्धन विफलताओं एक अवरोध नमूने में मौजूद संकेत हो सकता है। उस मामले में, किसी स्तंभ के साथ डीएनए सफाई अक्सर काफी रिश्तेदार बैक्टीरियल प्रचुरता बदलने के बिना अवरोधकों को हटा देगा। कई बैंड प्रवर्धन के बाद परिणाम हैं, तो एक अलग रिवर्स प्राइमर बारकोड के साथ नमूना फिर से बढ़ाना।
पर्यावरण प्रदूषण को रोकने और एक भी विशिष्ट उत्पाद के प्रवर्धन सुनिश्चित करने के लिए इसके अलावा, सफल अनुक्रमण जब पुस्तकालय पूल तैयारी देखभाल पर निर्भर करता है। लक्ष्य यह सुनिश्चित करने के लिए लगभग अनुक्रमण के एक ही नंबर का नमूना प्रति पढ़ता है प्रत्येक नमूना के amplicons की मात्रा में गठबंधन करने के लिए equimolar है। प्रायर प्रवर्धन के लिए न्यूक्लिक एसिड सांद्रता तुलना कर रहे हैं, बस प्रत्येक SA के बराबर मात्रा जोड़नेmple के amplicons पर्याप्त पुस्तकालय पूल बनाते समय है। हालांकि, अगर न्यूक्लिक एसिड सांद्रता बेहद अलग और बराबर मात्रा में जोड़ रहे हैं, कम न्यूक्लिक एसिड एकाग्रता के साथ नमूना खराब कम संख्या के साथ पढ़ता प्रतिनिधित्व किया जाएगा। इस मामले में, यह जेल बैंड के रिश्तेदार तीव्रता के आधार पर कम एकाग्रता नमूना से amplicons के एक उच्च मात्रा जोड़ने के लिए संभव है। वैकल्पिक रूप से, यह अधिक कड़ाई से, अलग-अलग amplicons से प्राइमरों दूर करने के लिए एक fluorometric dsDNA मात्रा का ठहराव किट का उपयोग कर व्यक्ति नमूना है amplicon एकाग्रता यों, और ठीक गठबंधन प्रत्येक नमूने की equimolar मात्रा संभव है।
एक बार एक अच्छी तरह से संतुलित amplicon पूल उत्पन्न होता है, इसे ध्यान से पूल की एकाग्रता को मापने के लिए महत्वपूर्ण हो जाता है। इसके बाद सावधान कमजोर पड़ने और कील में PhiX के साथ बढ़ाने के लिए पढ़ें जटिलता इष्टतम अनुक्रमण परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। उच्च throughput sequencers कि sequen का उपयोगसंश्लेषण द्वारा cing प्रवाह सेल पर क्लस्टर घनत्व बहुत संवेदनशील होते हैं। वह भी ध्यान केंद्रित किया गया है कम गुणवत्ता स्कोर, कम डेटा उत्पादन, और गलत demultiplexing 32 से overclustering में परिणाम है, एक पुस्तकालय पूल लदान। है कि बहुत पतला भी कम डेटा उत्पादन का परिणाम देगा एक पुस्तकालय पूल लोड हो रहा है। ध्यान से पुस्तकालय पूल बढ़ाता अनुक्रमण करने से पहले इष्टतम परिणाम सुनिश्चित करेगा।
-16 RRNA जीन अनुक्रमण किसी नमूने के भीतर मौजूद बैक्टीरिया की एक व्यापक मूल्यांकन प्रदान करता है और परिकल्पना की पीढ़ी में एक बिल्कुल महत्वपूर्ण पहला कदम है। मेटाडाटा आगे के एक अमीर सेट की उपस्थिति शोधकर्ता विशेष प्रजातियों के जीवाणु और महत्वपूर्ण जैविक कारकों के बीच संघों परीक्षण करने के लिए सक्षम बनाता है। इसके अलावा, एक ही -16 जानकारी जैसे PICRUSt 33 के रूप में उपकरण का उपयोग कर के साथ बैक्टीरियल कार्यों अनुमान किया जा सकता है। अंतिम लक्ष्य -16 लक्षण वर्णन का उपयोग करने के उपन्यास संघों है कि हो सकता है की पहचान हैआगे का परीक्षण और मॉडल प्रणाली में मान्य, मानव स्वास्थ्य और रोग पर बैक्टीरियल Microbiome के प्रभाव के बारे में हमारी बढ़ती समझ को जोड़ने।
The authors have nothing to disclose.
हम प्रोटोकॉल पर गंभीर प्रतिक्रिया के लिए एलिजाबेथ बर्न, डेविड Gootenberg, और क्रिस्टीना Gosmann का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं; मेगन Baldridge, स्कॉट Handley, सिंडी मोनाको, और जेसन नॉर्मन नमूना तैयार करने के लिए मार्गदर्शन और प्रदर्शनों के लिए; वेन्डी गैरेट, कर्टिस Huttenhower, छोड़ें वर्जिन, और ब्रूस वाकर प्रोटोकॉल सलाह और उपयोगी विचार विमर्श के लिए; और अनुक्रमण समर्थन के लिए जेसिका Hoisington-लोपेज। इस काम के बिल और मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन और NIAID (1R01AI111918) द्वारा समर्थित किया गया। DSK बरोज़ वेलकम कोष से अतिरिक्त सहायता प्राप्त किया। MNA NIGMS से पुरस्कार नंबर T32GM007753, और पॉल और डेजी सोरोस फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया। सामग्री केवल लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी NIGMS या एनआईएच की आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है।
Equipment: | |||
Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607 | |
PCR workstation | Any PCR hood can be used, e.g., the AirClean 600. | ||
Thermocycler | Any thermal cycler with a heated lid can be used, e.g., MJ Research PTC-200. | ||
Electrophoresis system | Any electrophoresis system can be used, e.g. the Thermo Scientific Owl EasyCast B1 Mini Gel Electrophoresis system. | ||
Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | Any other DNA quantification method will be sufficient |
Bioanalyzer | Agilent | 2100 | An alternative is the Agilent 2200 TapeStation Instrument. Not absolutely necessary but very helpful. |
MiSeq or HiSeq | Illumina | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials: | |||
Catch-All Sample Collection swab | Epibio | QEC89100 | Other swabs can be used but the Catch-All swab is recommended by the Human Microbiome Project. |
ELIMINase | Fisher | 04-355-31 | |
SteriFlip 50 mL filtration device (0.22 µm) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | |
2 mL screw-cap tubes | Sarstedt | 72.694.006 | For bead beating |
UltraPure 5M NaCl | Life Technologies | 24740-011 | Molecular Biology Grade |
1 M Tris-HCl | Ambion (Invitrogen) | AM9856 | Molecular Biology Grade |
0.5 M EDTA | Ambion (Invitrogen) | AM9260G | Molecular Biology Grade |
Sodium Dodecyl Sulfate, 20% Solution | Fisher | BP1311-200 | Molecular Biology Grade |
UltraPure DNase/RNase-free distilled water | Ambion | 10977-015 | Molecular Biology Grade, for buffer preparation |
2-Propanol BioReagent, for molecular biology, ≥99.5% | Sigma | I9516-500ML | Molecular Biology Grade |
Phenol:Chloroform:IAA, 25:24:1 | Invitrogen | AM9730 | Warning: Toxic |
3 M Sodium Acetate, pH 5.5 | Life Technologies | AM9740 | Molecular Biology Grade |
Disposable sterile polystyrene forceps, PS | Cole Parmer | EW-06443-20 | |
1.5 mL, clear, PCR clean tubes | Eppendorf | 22364120 | |
PCR grade water | MoBio | 17000-11 | For PCR |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
dNTP mix | Sigma | D7295-0.5mL | |
0.2 ml PCR 8-tube with attached clear flat caps, natural | USA Scientific | 1492-3900 | Any 8-tube strips that are DNase, RNase, DNA, and PCR inhibitor free will work |
Agarose | BioExpress | E-3121-25 | |
50X TAE buffer | Lonza | 51216 | |
DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
6X DNA Loading Dye | Thermo (Fisher) | R0611 | |
50bp GeneRuler Ladder | Thermo (Fisher) | SM0373 | |
AllPrep DNA/RNA kit | Qiagen | 80284 | |
UltraClean PCR Clean-up Kit | MoBio | 12500-100 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P11496 | An alternative is Qubit Fluorometric Quantification (Life Technologies) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primers: | |||
515F (forward primer) 5'-AATGATACGGCGACCACCGAG ATCTACACTATGGTAATTGT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3' |
Order at 100 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. **Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.** | ||
Reverse primers, see the Supplemental Code File and: ftp://ftp.metagenomics.anl.gov/data/misc/EMP/SupplementaryFile1_barcoded _primers_515F_806R.txt |
IDT is recommended | If ordering large sets of primers, order as a 96-well plate at the 100 nmole scale. Resuspend at 100 μM. Full directions for primer ordering and resuspension at http://www.earthmicrobiome.org/files/2013/04/EMP_primer_ordering_and _resuspension.doc. **Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.** |
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Read 1 Sequencing Primer 5'-TAT GGT AAT TGT GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3' | 25 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
Read 2 Sequencing Primer 5'-AGT CAG TCA GCC GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3' | 26 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
Index Sequencing Primer 5'-ATT AGA WAC CCB DGT AGT CCG GCT GAC TGA CT-3' | 27 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | Required if performing the sequencing in-house. If the sequencing will be performed by a third-party sequencing center, they will already have PhiX. |