LC-MS Analyse des plaquettes humaines en tant que plate-forme pour l'étude du métabolisme mitochondrial
Summary
Ici , nous montrons les plaquettes humaines isolées peuvent être utilisées comme accessibles modèle ex vivo pour étudier les adaptations métaboliques en réponse au complexe I inhibiteur de la roténone. Cette approche utilise le traçage isotopique et la quantification relative par spectrométrie de masse Chromatographie en phase liquide, et peut être appliquée à une variété de modèles d'étude.
Abstract
Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.
Introduction
Le métabolisme mitochondrial dysfonctionnelle a été impliquée dans un large éventail de maladies , y compris la neurodégénérescence, le cancer et les maladies cardiovasculaires 30. En tant que tel, un grand effort a été mis sur la caractérisation des défauts métaboliques qui contribuent à la pathogenèse de la maladie. Chromatographie en phase liquide-spectrométrie de masse tandem (LC-MS / MS) est considéré comme l'étalon-or pour la quantification des analytes de matrices biologiques complexes et est souvent utilisé pour les études métaboliques 8. Cependant, comme cela est souvent le cas avec des études biomédicales, la réalisation d'un modèle accessible et bien défini pertinents à la maladie humaine est un défi.
De nombreuses études emploient des modèles cellulaires transformées pour sonder l'impact des xénobiotiques ou des anomalies génétiques sur le métabolisme cellulaire 7,9. La reprogrammation métabolique qui se produit dans les cellules cancéreuses peuvent introduire des facteurs de confusion 21 et ne sont donc pas idéales. Ces questions peuvent être circumvented avec des modèles de cellules primaires, bien que l'obtention d'une biomasse suffisante pour les analyses métaboliques peut être difficile. En outre, l'impact de grandes quantités d'antibiotiques utilisés dans la culture a été mis en évidence que des études mitochondriales potentiellement confondants 16.
Des plaquettes humaines offrent la possibilité d'utiliser un modèle de cellules primaires avec un contenu mitochondrial suffisante pour les études métaboliques 5,22,27,32. Tout d'abord, les plaquettes peuvent être facilement acquis, par le sang attire de donateurs individuels, ou dans de grands volumes de banques de sang, et donc fournir un modèle dans lequel les facteurs externes peuvent être facilement contrôlés. Deuxièmement, en raison de leur petite taille, les plaquettes peuvent être facilement isolés des autres composants du sang avec le travail préparatoire minimale dans les laboratoires même peu équipés 5. Il faut noter que les plaquettes ne contiennent pas de noyaux et peuvent donc être utilisés pour étudier les altérations du métabolisme indépendamment de la régulation de la transcription. Ici, nous montrons queen plus de la quantification relative de l'acyl-coenzyme A (CoA-thioesters), le système plaquettaire isolé peut être utilisé pour étudier le métabolisme du carbone. Plus précisément, nous rapportons l'utilisation de marquage métabolique avec des isotopes stables (non radioactif) marqué [13 C 6] Glucose et [13 C 16] palmitate pour sonder l' incorporation de la [13 C] -label dans l'importante acétyl métabolite CoA par l'intermédiaire de la glycolyse ou l'oxydation des acides gras. Ceci fournit une plate – forme puissante, généralisable, et polyvalent en raison de la forte implication des espèces acyl-CoA dans les voies biochimiques 13,24 et la traçabilité de ce système à l' essai d' autres variables, telles que l' inhibition de I complexe avec roténone 3,33. En plus des informations fournies dans le protocole ci – dessous, une description détaillée des méthodes utilisées pour le marquage isotopique et pour les analyses basées sur LC-MS peut être trouvée dans Basu et Blair 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous avons démontré l'utilité des plaquettes isolées en tant que plate-forme pour étudier le métabolisme mitochondrial perturbé. Plus précisément, nous avons caractérisé l'adaptation métabolique en réponse au complexe I inhibition par la roténone.
La présente étude a étendu les résultats rapportés précédemment sur le rôle de I inhibition complexe par la roténone dans des lignées cellulaires à des plaquettes humaines. Surtout, ce qui a révélé que la fo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons l'appui des NIH subventions P30ES013508 et T32ES019851.
Materials
| Reagent | |||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| 13C6-Glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| Palmitic acid | Cayman | 10006627 | |
| 13C16-Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | 605573 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Trichloro Acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| 5-Sulfosalicylic Acid | Sigma-Aldrich | 390275 | |
| Acetonitirle | Fischer Scientific | A996-4 | (optima) |
| Water (H2O) | Fischer Scientific | W7-4 | (optima) |
| Formic acid | Fischer Scientific | 85171 | (optima) |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Ethanol | Fischer Scientific | 04-355-222 | |
| Methanol | Fischer Scientific | A454-4 | (optima) |
| Ammonium Acetate | Fischer Scientific | A639-500 | |
| 2 mL Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | |
| LC vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 10 mL Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns | Waters | WAT094225 | |
| Pastuer Pipets | Fischer Scientific | 13-678-200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CO2 Water-Jacketed Incubator | Nuaire | AutoFlow NU-8500 | |
| Triple Quadropole Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Finnigan TSQ Quantum | |
| HPLC | Thermo Scientific | Dionex Ultimate 3000 | |
| Source | Thermo Scientific | HESI II | |
| HPLC Column | Phenomenex | Luna C18 | 3 μm particle size, 200 mm x 2 mm |
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