Análise de LC-MS de Plaquetas Humanas como Plataforma para Estudar o Metabolismo Mitocôndrial
Summary
Aqui mostramos plaquetas humanas isoladas podem ser usadas como uma acessível ex vivo modelo para estudar adaptações metabólicas em resposta ao inibidor do complexo I rotenona. Esta abordagem emprega rastreio isotópica e quantificação relativa por espectrometria de massa de cromatografia de líquido e pode ser aplicado a uma variedade de modelos de estudo.
Abstract
Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.
Introduction
Metabolismo mitocondrial disfuncional tem sido implicada numa ampla variedade de doenças, incluindo a neurodegeneração, cancro, doenças cardiovasculares e 30. Como tal, um grande esforço foi colocado sobre a caracterização de defeitos metabólicos que contribuem para a patogénese da doença. Espectrometria de massa de cromatografia líquida-tandem (LC-MS / MS) é considerada o padrão-ouro para a quantificação de analitos a partir de matrizes biológicas complexas e muitas vezes é empregada para estudos metabólicos 8. No entanto, como é frequentemente o caso com estudos biomédicos, atingindo um modelo acessível e bem definida relevantes para doenças humanas é um desafio.
Muitos estudos empregam transformado modelos celulares para sondar o impacto de xenobióticos ou anormalidades genéticas no metabolismo celular 7,9. A reprogramação metabólica que ocorre em células cancerosas podem introduzir factores de confusão 21 e, portanto, não são ideais. Estas questões podem ser circumvented com modelos de células primárias, embora a obtenção de biomassa suficiente para análises metabólicas pode ser um desafio. Além disso, o impacto de elevadas quantidades de antibióticos utilizados na cultura tem sido destacado como estudos mitocondriais potencialmente de confusão 16.
Plaquetas humanas dar a oportunidade de utilizar um modelo de célula primária com conteúdo mitocondrial suficiente para estudos metabólicos 5,22,27,32. Em primeiro lugar, as plaquetas podem ser facilmente adquiridos, através de exames de sangue de doadores individuais, ou em grandes volumes de bancos de sangue e, portanto, fornecer um modelo em que fatores externos podem ser facilmente controlado. Em segundo lugar, devido ao seu pequeno tamanho, as plaquetas podem ser facilmente isolados a partir de outros componentes do sangue com o trabalho preparatório mínima em laboratórios mesmo minimamente equipados 5. Digno de nota, as plaquetas não contêm núcleo e pode, portanto, ser usadas para estudar alterações ao metabolismo independentemente da regulação da transcrição. Aqui nós mostramos queAlém de quantificação relativa de tioésteres de acil-coenzima A (CoA), o sistema de plaquetas isoladas podem ser usadas para analisar o metabolismo de carbono. Especificamente, nós relatamos o uso de marcação metabólica com isótopo estável (não radioativo) marcado [13 C 6] -glucose e [13 C 16] -palmitato para sondar incorporação da [13 C] -label para o importante acetil metabólito CoA através da glicólise ou da oxidação de ácidos gordos. Isto proporciona uma plataforma poderosa, generalizável, e versátil devido ao amplo envolvimento de espécies acil-CoA em vias bioquímicas 13,24 ea rastreabilidade deste sistema para testar outras variáveis, tais como a inibição do complexo I com rotenona 3,33. Além das informações fornecidas no protocolo a seguir, uma extensa descrição dos métodos utilizados para a rotulagem isótopo e para as análises baseadas em LC-MS pode ser encontrado em Basu e Blair 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui temos demonstrado a utilidade de plaquetas isoladas como uma plataforma para o estudo do metabolismo mitocondrial perturbado. Especificamente, temos caracterizado adaptação metabólica em resposta à inibição do complexo I por rotenona.
O presente estudo se estendeu resultados reportados anteriormente sobre o papel da inibição do complexo I por rotenona em linhas celulares para plaquetas humanas. Importante, este revelou que a formação de rotenona também inibida de plaquetas su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o apoio do NIH subvenções P30ES013508 e T32ES019851.
Materials
| Reagent | |||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| 13C6-Glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| Palmitic acid | Cayman | 10006627 | |
| 13C16-Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | 605573 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Trichloro Acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| 5-Sulfosalicylic Acid | Sigma-Aldrich | 390275 | |
| Acetonitirle | Fischer Scientific | A996-4 | (optima) |
| Water (H2O) | Fischer Scientific | W7-4 | (optima) |
| Formic acid | Fischer Scientific | 85171 | (optima) |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Ethanol | Fischer Scientific | 04-355-222 | |
| Methanol | Fischer Scientific | A454-4 | (optima) |
| Ammonium Acetate | Fischer Scientific | A639-500 | |
| 2 mL Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | |
| LC vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 10 mL Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns | Waters | WAT094225 | |
| Pastuer Pipets | Fischer Scientific | 13-678-200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CO2 Water-Jacketed Incubator | Nuaire | AutoFlow NU-8500 | |
| Triple Quadropole Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Finnigan TSQ Quantum | |
| HPLC | Thermo Scientific | Dionex Ultimate 3000 | |
| Source | Thermo Scientific | HESI II | |
| HPLC Column | Phenomenex | Luna C18 | 3 μm particle size, 200 mm x 2 mm |
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