Immobilisering af Multi-biokatalysatorer i alginatkugler for cofaktor Regeneration og Forbedret Genbrugelighed

Summary

Præsenteret er protokollen for co-immobilisering hel-celle biokatalysatorer til cofaktor regenerering og forbedret genanvendelighed, ved hjælp af produktion af L-xylulose som eksempel. Cofaktoren regenerering opnås ved kobling to Escherichia coli stammer, der udtrykker funktionelt komplementære enzymer; helcelle-biokatalysator immobilisering opnås ved celleindkapsling i calciumalginatperler.

Abstract

Vi har for nylig udviklet en enkel, genanvendelige og koblet hel-celle biokatalytisk systemet med evnen til cofaktor regenerering og biokatalysator immobilisering til forbedret fremstilling udbytte og vedvarende syntese. Beskrevet hermed er den eksperimentelle procedure for udviklingen af et sådant system, der består af to E. coli-stammer, der udtrykker funktionelt komplementære enzymer. Sammen kan disse to enzymer fungere kooperativt at mediere regenerering af dyre cofaktorer til forbedring af produktudbyttet af bioreaktion. Desuden rapporteres fremgangsmåden til syntetisering en immobiliseret form af den koblede biokatalytiske system ved indkapsling af hele celler i calciumalginatperler. Som et eksempel, præsenterer vi den forbedrede biosyntesen af L-xylulose ud fra L-arabinitol ved kobling E. coli-celler, der udtrykker enzymerne L-arabinitol dehydrogenase eller NADH oxidase. Under optimale betingelser og under anvendelse af en initial koncentration på 150mM L-arabinitol, nåede den maksimale L-xylulose udbytte 96%, hvilket er højere end dem, der rapporteres i litteraturen. Den immobiliseret form af de koblede hel-celle biokatalysatorer viste god driftsstabilitet, vedligeholdelse 65% af udbyttet opnået i den første cyklus efter 7 cykler af successiv genbrug, mens det frie celle systemet næsten helt mistet den katalytiske aktivitet. Derfor metoder rapporteret her giver to strategier, som kunne hjælpe med at forbedre den industrielle produktion af L-xylulose samt andre tillægstjenester forbindelser kræver brug af cofaktorer i almindelighed.

Introduction

Reduktiv helcelle-biotransformation anvendelse af mikroorganismer er blevet en udbredt fremgangsmåde til kemo-enzymatiske syntese af kommercielt og terapeutisk vigtige biomolekyler ^{1 – 3.} Den præsenterer en række fordele i forhold til brugen af isolerede enzymer, især afskaffelse af omkostningstunge downstream rensningsprocesser og demonstration af en forlænget levetid ^{4 – 7.} For biokatalytiske veje hvor der kræves cofaktorer for produktdannelse, hel-celle-systemer har potentiale til at tilvejebringe in situ cofaktor regenerering via tilsætning af billige elektrondonerende co-substrater ^5,8,9. Imidlertid er denne kapacitet formindskes til reaktioner, der kræver et støkiometrisk koncentration af sjældne eller dyre co-substrater ^{10 – 13.} Sammen med dårlig genanvendelighed af hele celler, dette vanskeliggør etableringen af ​​en skalerbar og løbende produktion system. Strategiske modifikationer af hel-celle-systemer til disse cofaktor-afhængige biotransformation skal overvinde de førnævnte begrænsninger. Konkret har kombinationen af hel-celle biokatalysatorer, der arbejder kooperativt er vist signifikant at øge produktiviteten og stabiliteten af de nærede enzymer ^14. Disse faktorer, som ofte kritiske for, at storstilet produktion af kommercielt levedygtige produkter, kan optimeres yderligere ved co-immobilisering biokatalytiske mikrober ^15. Vi har for nylig udviklet en enkel og genbruges helcelle biokatalytisk system, der tillader både cofaktor regenerering og biokatalysator immobilisering for L-xylulose produktion ^16. I denne undersøgelse blev dette system anvendes som et eksempel for at illustrere de eksperimentelle procedurer anvendelsen af ​​disse to strategier til forbedret biotransformation produktionsudbyttet og biokatalysator genanvendelighed.

L-xylulose tilhører en class af biologisk nyttige molekyler opkaldt sjældne sukre. Sjældne sukkerarter er unikke monosaccharider eller sukkerderivater, der forekommer meget sjældent i naturen, men spiller afgørende roller som anerkendelse elementer i bioaktive molekyler ^17,18. De har en række ansøgninger fra sødemidler, funktionelle fødevarer til potentielle terapeutika ^19. L-xylulose kan anvendes som en potentiel inhibitor af flere a-glucosidaser, og kan også anvendes som en indikator for hepatitis eller levercirrose ^17,20. Højeffektiv omdannelse af xylitol til L-xylulose i hel-celle-systemer er tidligere blevet rapporteret i Pantoea ananatis ^21,22, Alcaligenes sp. 701 B ^23, Bacillus pallidus Y25 ^24,25 og Escherichia coli ^26. I E. coli, blev det imidlertid kun opnås ved hjælp af lav (<67 mM) xylitol koncentrationer ²⁶ på grund af potentielle hæmmende virkninger af en startkoncentration xylitol højere end 100 mm på xylitol-4-dehydrogenase aktivitet ^21,26. Den termodynamiske ligevægt mellem xylulose og xylitol har vist sig at kraftigt favoriserer dannelsen af xylitol ^25,27. Derudover er xylulose udbytte begrænset af mængden af dyre cofaktorer, der skal leveres i mangel af en di situ cofaktor regenerering system. Tilsammen udgør disse faktorer begrænse mulighederne for skalering til bæredygtige systemer til L-xylulose biosyntese.

For at overvinde disse begrænsninger og forbedre L-xylulose biotransformation udbytte blev strategien for cofaktor regenerering ansat først ved at etablere en koblet hel-celle biokatalytisk system. Specifikt L-arabinitol-4-dehydrogenase (EF 1.1.1.12) fra Hypocrea jecorina (HjLAD), et enzym i L-arabinose kataboliske pathway af svampe, blev udvalgt til at katalysere omdannelsen af L-arabinitol til L-xylulose ^28,29 . Ligesom mange biosyntetiske enzymer, en større limitation af HjLAD er, at det kræver en støkiometrisk mængde af den dyre nikotinamidadenindinukleotid cofaktor (NAD ⁺ er den oxiderede form af NADH) at udføre denne omdannelse. NADH oxidase fundet i Streptococcus pyogenes (SpNox) har vist sig at vise high cofaktor-regeneration aktivitet ^30,31. Ved at udnytte denne egenskab ved SpNox, E. coli-celler, der udtrykker HjLAD til produktion af L-xylulose blev koblet med E. coli-celler, der udtrykker SpNox til regenerering af NAD ⁺ til at øge L-xylulose produktion afbildet ved den koblede reaktion er vist i figur 1A. Under optimale betingelser og under anvendelse af en initial koncentration på 150 mM L-arabinitol, nåede den maksimale L-xylulose udbytte 96%, hvilket gør dette system meget mere effektiv end dem rapporteret i litteraturen.

Strategien med hel-celle-immobilisering blev anvendt næste for yderligere at forøge genanvendeligheden af ​​det koblede biocatalytic-system. Almindeligt anvendte metoder til hel-celle immobilisering omfatter adsorption / kovalent linker til faste matricer, cross-linking / indespærring og indkapsling i polymere netværk ^32. Blandt disse fremgangsmåder er den mest egnede fremgangsmåde til celle immobilisering er indkapsling i calciumalginatperler. Deres milde geleringsegenskaber, inaktivt vandig matrix og høj porøsitet bidrage til at bevare de fysiologiske egenskaber og funktionalitet af de indkapslede biologiske ^33. Derfor er den koblede biokatalysator indeholdende både E. coli celler indeholdende HjLAD eller SpNox blev immobiliseret i calcium alginat perler til at gøre det muligt for flere cykler af L-xylulose produktion (figur 2) .Den immobiliserede biokatalysator systemet viste god driftsstabilitet, vedligeholdelse 65% af konverteringen udbyttet af den første cyklus efter 7 cykler af successive genbrug, mens det frie celle systemet næsten helt mistet sin katalytiske aktivitet.

Protocol

1. helcelle Biocatalysts Fremstilling BEMÆRK: Det rekombinante E. coli celler indeholdende pET28a- SpNox 31 eller pET28a- HjLAD 28 er følgende benævnt E. coli SpNox og E. coli HjLAD henholdsvis. Inokulere en enkelt koloni af E. coli HjLAD i 3 ml Luria-Bertani (LB) medium suppleret med kanamycin (50 ug / ml) og inkuberes i en inkubator-ryster O / N ved 37 ° C, 250 rpm. </…

Representative Results

For at aktivere cofaktor regenerering blev L-xylulose syntese udført i en koblet helcelle biokatalytisk indeholdende E. coli HjLAD og E. coli SpNox celler. Efter optimering af forskellige parametre blev genanvendelighed af dette system forbedres ved at immobilisere det på calcium alginatkugler (figur 2). L-xylulose Produktion med cofaktor Rege…

Discussion

Den seneste teknologiske fremskridt har muliggjort en kraftig stigning i kommercialiseringen af ​​rekombinante bioterapeutiske, hvilket resulterer i en gradvis stigning i deres markedsværdi i den bioteknologiske industri. En sådan avancement er fremkomsten af metabolic engineering i rekombinante mikroorganismer, som har vist en meget lovende i etableringen skalerbare industrielle systemer ^38. Som med de fleste processer, vellykket kommercialisering af rekombinante biomolekyler fremstillet ved genetisk m…

Materials

LB broth	Sigma Aldrich	L3022-6X1KG
Kanamycin	Fisher	BP906-5
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758-10G
Tris base	Fisher	BP1521
B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate	Sigma Aldrich	N7004-1G
L-Arabinitol	Sigma Aldrich	A3506-10G
L-Cysteine	Sigma Aldrich	168149
Sulfuric acid	Sigma Aldrich	320501-500ML
Carbazole	Sigma Aldrich	C5132
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Sodium alginate	Sigma Aldrich	W201502
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	223506-500G
Excella E24 shaker incubator	New Brunswick Scientific
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer	Agilent Technologies
Centrifuge 5810R	Eppendrof
Beakers	Fisher
Syringe	Fisher
Needle	Fisher
Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance	Ohaus