קיבוע של biocatalysts רב בחרוזים אלגינט עבור פקטור רגנרציה Reusability משופר

Summary

מוצג פרוטוקול biocatalysts כל תא שיתוף משתק להתחדשות פקטור ויכולת שימוש חוזרת משופר, באמצעות הייצור של L-xylulose כדוגמא. התחדשות פקטור מושגת על ידי צימוד שני זני Escherichia coli להביע אנזימים משלימים מבחינה תפקודית; וקיבוע biocatalyst כל תא מושגת על ידי אנקפסולציה תא חרוזים אלגינט סידן.

Abstract

פתחנו לאחרונה מערכת biocatalytic פשוט, לשימוש חוזר ו מצמידה כל תא עם יכולת התחדשות פקטור וקיבוע biocatalyst תשואת ייצור משופרת וסינתזה מתמשכת. בזאת הוא תאר את הליך הניסויים לפיתוח של מערכת כזו מורכב משני E. קולי זני המבטאים אנזימים משלימים מבחינה תפקודית. יחד, שני אנזימים אלה יכולים לתפקד שיתוף ניתוח לתווך ההתחדשות של קו-פקטורים יקרים לשיפור תפוקת התוצר של bioreaction. בנוסף, השיטה של ​​סינתזת צורה משותקת של מערכת biocatalytic מצמידה ידי אנקפסולציה של תאים שלמים בחרוזי אלגינט סידן מדווחת. כדוגמא, אנו מציגים את ביוסינתזה המשופרת של L-xylulose מ L-arabinitol ידי צימוד E. קולי תאים המבטאים את האנזימים dehydrogenase L-arabinitol או מונואמין NADH. בתנאים אופטימליים ושימוש בריכוז ההתחלתי של 150המ"מ L- arabinitol, תשואת L-xylulose המקסימאלי הגיעה 96%, שהוא גבוה יותר מאשר אלו המדווחים בספרות. הצורה המשותקת של biocatalysts כל תא המצמידים הפגינה יציבות תפעולית טובה, שמירת 65% מהתשואה שהושגה במחזור הראשון אחרי 7 מחזורים של שימוש חוזר רצוף, בעוד מערכת תא חינם כמעט לחלוטין אבדה את הפעילות הקטליטית. לכן, שיטות דיווח כאן מספק שתי אסטרטגיות שיכול לעזור לשפר את הייצור התעשייתי של L-xylulose, וכן תרכובות ערך מוסף אחרים המחייבים את השימוש קו-פקטורים בכלל.

Introduction

Biotransformation כל תא רדוקטיבי באמצעות מיקרואורגניזמים הפך שיטה נפוצה לסינתזת האנזימטית הכימותרפיה של ביומולקולות בעלי חשיבות המסחרית טיפולי ^{1 – 3.} היא מציגה מספר יתרונות על פני השימוש של אנזימים מבודדים, בעיקר החיסול של תהליכי טיהור במורד זרם עתיר עלות לבין ההפגנה של חיים מורחבים ^{4 – 7.} לקבלת מסלולים biocatalytic שבו קו-פקטורים נדרשים ליצירת מוצר, מערכות תא כולו יש פוטנציאל לספק בהתחדשות פקטור באתרו באמצעות התוספת של ^5,8,9 שיתוף מצעים לתרום אלקטרונים זולים. עם זאת, היכולת הזו היא פחתה לתגובות הדורשות ריכוז stoichiometric של מצעי שיתוף נדירים או יקרים ^{10 – 13.} יחד עם שימוש חוזר עני של תאים שלמים, זה מקשה על הקמת produ מדרגי הרציףמערכת ction. שינויים אסטרטגיים של מערכות שלמות תאים עבור biotransformations פקטור תלויי אלה נדרשים להתגבר על המגבלות הנ"ל. באופן ספציפי, שילוב של biocatalysts כל התא שפועלים בשיתוף פעולה הוכח באופן משמעותי כדי לשפר את הפרודוקטיביות ואת היציבות של האנזימים טפחו ^14. גורמים אלו, אשר לעתים קריטיים המאפשרים ייצור בקנה מידה הגדולה של מוצרים בכמות מסחרית, יכולים להיות מותאמים יותר על ידי חיידקי biocatalytic משתק שיתוף ^15. פיתחנו לאחרונה מערכת biocatalytic פשוט לשימוש חוזר כל תא המאפשר גם התחדשות פקטור וקיבוע biocatalyst לייצור L-xylulose ^16. במחקר זה, מערכת זו נוצלה כדוגמה כדי להמחיש את הפרוצדורות של במסגרתו קיימות שתי אסטרטגיות אלה תשואה ייצור biotransformation משופרת ויכולת השימוש החוזר biocatalyst.

L-xylulose שייך CLAss של מולקולות ביולוגיות שימושיות בשם סוכרים נדירים. סוכרים נדירים הם מונוסכרידים ייחודיים או נגזרי סוכר המתרחשים לעתים נדירות מאוד בטבע, אבל לשחק תפקידים מכריעים כאלמנטי הכרה במולקולות ביו ^17,18. יש להם מגוון של יישומים החל ממתיקים, מזון פונקציונלי ל ^-19 רפויות פוטנציאלי. L-xylulose יכול לשמש מעכב פוטנציאל של α-glucosidases המרובה, עשוי לשמש גם כאינדיקטור של שחמת כבד או דלקת כבד ^17,20. המרה יעילות גבוהה של קסיליטול כדי L-xylulose במערכות כל תא דווחה בעבר Pantoea ananatis ^21,22, Alcaligenes sp. ²³ 701B, pallidus Bacillus ^24,25 Y25 ו Escherichia coli ^26. בתוך א ' coli, לעומת זאת, הושג אותו באמצעות נמוכים בלבד (<67 מ"מ) ריכוזים קסיליטול ²⁶ בשל השפעתו מעכבת פוטנציאל של ריכוז קסיליטול ראשוני גבוה יותר מ 100 מ"מ על פעילות קסיליטול-4-דהידרוגנז ^21,26. שיווי המשקל התרמודינמי בין xylulose ו קסיליטול הוכח בחום להעדיף היווצרות של קסיליטול ^25,27. בנוסף, תשואת xylulose מוגבלת על ידי הכמות של קו-פקטורים יקרים כי צריך להיות מסופקים בהעדר במערכת התחדשות הפקטור באתרו. יחד, גורמים אלה מצמצמים את פוטנציאל ההתרחבות לתוך מערכות קיימא עבור ביוסינתזה L-xylulose.

כדי להתגבר על המגבלות האלה ולשפר את תשואת biotransformation L-xylulose, האסטרטגיה של התחדשות פקטור הועסקה לראשונה על ידי הקמת מערך biocatalytic כל תא מצמיד. באופן ספציפי, L-Arabinitol 4-dehydrogenase (EC 1.1.1.12) מ Hypocrea jecorina (HjLAD), אנזים במסלול קטבולי L-arabinose של פטריות, נבחרה לזרז את ההמרה של L-arabinitol לתוך L-xylulose ^28,29 . כמו אנזימי biosynthetic רבים, limitatio גדולהn של HjLAD הוא שזה דורש כמות stoichiometric של פקטור אדנין dinucleotide nicotinamide היקר (NAD ^+, בצורת החמצון של NADH) לבצע המרה זו. מונואמין מצאו NADH ב pyogenes סטרפטוקוקוס (SpNox) הוכח להציג-התחדשות-פקטור גבוה פעילות ^30,31. ניצול של תכונה זו של SpNox, E. קולי תאים המבטאים HjLAD לייצור-xylulose L היו מצמידים עם E. קולי תאי מבטאי SpNox להתחדשות של NAD ⁺ כדי להגביר את ייצור L-xylulose מתואר על ידי התגובה המצמידה מוצגת באיור 1 א. בתנאים אופטימליים ושימוש בריכוז ההתחלתי של 150 מ"מ L- arabinitol, התשואה L-xylulose מקסימלי הגיעו 96%, מה שהופך את המערכת הרבה יותר יעיל מאלו שדווחו בספרות.

האסטרטגיה של חוסר תנועה כל התא הועסקה הבאה לשפר עוד יותר את השימוש החוזר של biocatalyt מצמידמערכת IC. בדרך כלל שיטות המשמשות וקיבוע כל תא כוללות ספיחה / קוולנטיים מקשרים מטריצות מוצקות, cross-linking / מלכוד אנקפסולציה ברשתות פולימריים ^32. בין גישות אלה, בשיטה המתאימה ביותר עבור קיבוע התא הוא אנקפסולציה בחרוזים אלגינט סידן. נכסי gelation הקלים שלהם, מטריקס מימית אינרטי נקבובית גבוה לעזור לשמר את המאפיינים פיסיולוגיים ופונקציונלית של הביולוגיות במארז ^33. לכן, מערכת biocatalyst מצמידים המכילה הוא E. קולי תאים מחסה HjLAD או SpNox היה משותק חרוזים אלגינט סידן לאפשר מחזורים רבים של ייצור L-xylulose (איור 2) .the מערכת biocatalyst משותקת הפגינו יציבות תפעולית טובה, שמירה 65% מהתשואה המרה של המחזור הראשון אחרי 7 מחזורים של שימוש חוזר רצוף, בעוד מערכת תא חינם כמעט לחלוטין אבדה הפעילות הקטליטית שלו.

Protocol

1. Whole-cell biocatalysts הכנה הערה: א רקומביננטי קולי תאים מחסה pET28a- SpNox 31 או pET28a- HjLAD 28 להלן מכונים E. coli SpNox וא coli HjLAD, בהתאמה. לחסן מושבה אחת של E. coli</…

Representative Results

כדי לאפשר התחדשות פקטור, סינתזת L-xylulose בוצעה במערכת biocatalytic כל תא מצמידים המכילה E. coli HjLAD וא תאי SpNox coli. בעקבות אופטימיזציה של פרמטרים שונים, השימוש החוזר של מערכת זו שופר על ידי משתק אותו חרוזי אלגינט סידן (איור …

Discussion

פיתוחים טכנולוגיים אחרונים אפשרו התפרצות של המסחור של Biotherapeutics רקומביננטי, וכתוצאה מכך עלייה הדרגתית בשווי השוק שלהן בתעשיית הביוטכנולוגיה. קידום אחת כזו הוא כניסתו של הנדסת מטבולית מיקרואורגניזמים רקומביננטי, אשר הוכיחה הבטחה גדולה בהקמת ³⁸ מערכות תעשייתיות…

Materials

LB broth	Sigma Aldrich	L3022-6X1KG
Kanamycin	Fisher	BP906-5
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758-10G
Tris base	Fisher	BP1521
B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate	Sigma Aldrich	N7004-1G
L-Arabinitol	Sigma Aldrich	A3506-10G
L-Cysteine	Sigma Aldrich	168149
Sulfuric acid	Sigma Aldrich	320501-500ML
Carbazole	Sigma Aldrich	C5132
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Sodium alginate	Sigma Aldrich	W201502
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	223506-500G
Excella E24 shaker incubator	New Brunswick Scientific
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer	Agilent Technologies
Centrifuge 5810R	Eppendrof
Beakers	Fisher
Syringe	Fisher
Needle	Fisher
Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance	Ohaus