本文介绍了使用上的部分的免疫荧光染色爪蟾胚胎的中枢神经系统的可视化不同的神经元细胞群既方便又快速的方法。
Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.
在脊椎动物中,对中枢神经系统的发展包括几个独特的但连续的阶段。第一步是神经诱导,当幼稚外胚层细胞向神经命运,而不是表皮命运指定。几个相互连接的监管机制在这个阶段在非洲爪蟾和其他模型系统1,2参与。此过程主要由底层中胚层产生的分泌的因素,例如脊索头发生素,和卵泡抑素3-7协调。神经诱导之后,神经祖细胞的一个子集退出细胞周期,并开始在被称为主神经发生的方法来区分。不是所有的神经元前体分化在这个时候。剩余的神经前体细胞继续增殖,从而保持所需的整个发展和到成年中枢神经系统的持续增长的干细胞池。
这些公关oliferating神经前体细胞通过它们的SRY(性别决定区Y)-box 3(SOX3)基因8-11的表达为特征。细胞的其他人口,其出口处的细胞周期和承诺分化命运,由分化基因标记, 微管蛋白的表达,β确定2B IIb类 (tubb2b,N-桶 )和髓鞘转录因子1(MYT1) 12-14。这种分化的神经元细胞最终产生不同类别的神经元,包括但不限于,电动机,间,和神经管15-17内定位在不同的区域的感觉神经元。
虽然显著努力,一直致力于揭露支配的图案和命运确定前神经外胚层事件的监管机制,较少注意已经取得了查处发生后的神经性事件初始阶段的图案。事实上,信号转导,转录法规,以及翻译后修饰都参与了这一后期,神经18-20期间同时控制定时和谱系规范。进一步调查这些机制需要一个可靠的方法来轻松查看并区分神经细胞的不同人群。上述神经标记物,包括,SOX3,MYT1,和N-浴盆,可用于识别这些不同的细胞群体,从而提供为揭示神经元分化21-23的基本机制的必要基础的装置。
虽然神经元细胞群体的差异化标记已经在其他模式生物已经证明,相对很少有研究利用了爪蟾系统在这方面充分。这主要是由于兼容的抗体的缺乏可靠地识别各种neurOnal地区的细胞群中的神经管。在这里,我们描述了通过免疫染色,它提供了在爪调查初级神经发生一个强大的和方便的方法在早期爪蟾胚胎可视化神经元分化的方法。这个协议应该给舞台26级45之间有意在非洲爪蟾中枢神经系统的早期开发的研究人员充分的指导。
这里,我们证明了在爪蟾胚胎可视化的主要神经发生了方便快捷的方法。此方法允许不同类型的神经细胞,包括使用细胞类型特异性标记物的神经元干细胞和分化的原代神经元的评估。
该协议是普遍强劲具有非常高的水平的再现性。对于那些在预孵化阶段的胚胎( 即高达28期),我们建议您手动删除固定之前,卵黄膜,因为这可以让胚胎固定前充分舒展。在相对早期阶段收集时胚胎(孵化前)时,由于弯曲的胚胎是极难在安装室内部的期望的方向来安排,这是特别重要的。我们没有经历免疫原性MEMFA或PFA固定,因此附加抗原修复工序之后的损失是没有必要的此协议。此外,这种免疫染色过程可以在样品从显色/荧光原位杂交来进行。在这样的情况下,建议跳过原位杂交协议期间蛋白酶K处理步骤。色/荧光底物反应后,将样品可以用TBS洗涤并嵌入鱼明胶溶液中以类似的方式MEMFA / PFA固定的样品。样品瓶可以通过包裹在铝箔小瓶如果荧光原位杂交将连同免疫荧光染色后成像避光。
在一些情况下,胚胎可能明胶渗透后过度收缩。这是最有可能不是固定不充分或不够TBS-的Triton提取造成的。确保胚胎已被固定在PFA / MEMFA至少2-3小时或最好过夜4℃。如果问题仍然存在,加大TBS-的Triton的洗涤时间,以3 1小时。
在低温sectio宁,样本块的刚性可能会有所不同鱼明胶作为不同批次具有不同的属性。这个问题可以通过调整切片机的温度来部分地补偿。较低的温度会导致一个“难”样本块然而在过高的温度低样本块变得脆,难以部分。一些微调或每次练习之前切片(使用模拟样本块无胚胎)可能是有益的前上使用特别有价值的样品。
切片过程中经常遇到的问题是薄片有时往往粘在厚玻璃板上,而不是留平在钢阶段。这可能是特别破坏,因为它经常中断连续切片过程。节室和(特别是)厚玻璃板不是机器和o在够冷,或过多的静电荷:此类案件通常由两个原因之一perator,特别是在干燥的天气。前者可通过转动向下部腔室的温度和离开内的玻璃板额外的时间(可能是过夜)来解决;而后者通过适当的接地低温恒温器。低温恒温器的金属表面连接到一个金属抽头或金属制成的类似水管道系统可以以释放静电荷的另一种方式。每次使用后,在厚玻璃板应很好非腐蚀性洗涤剂(例如餐具洗涤液),通过超纯水漂洗洗涤,用纯乙醇喷洒,并包裹在毛巾纸保护表面和边从有害的。
在协议中列出的抗体通常是具体的,我们很少遇到的非特异性吸附或高背景信号。应当指出的是,如果用热灭活的山羊/羔羊血清作为封闭剂,过量的热失活(如可视化通过在血清中形成蓬松沉淀剂)应避免,因为这沉淀是到的第二抗体极具吸引力,并可能有助于高背景的来源。
这是可能的,有时需要,以执行双重染色同时形象化神经元细胞的不同群体。这种双重染色是可能的,一般给出了以下组合令人满意的效果:SOX3 / N-浴缸或MYT1 / N桶。然而,SOX3和MYT1的双重染色是由一个事实,即两种抗体都来自兔原点复杂。我们已经测试了几个抗体直接标记的试剂盒,但没有令人满意的结果,观察到(低信号对噪声电平),这可能是由于缺乏从二级抗体信号放大。一个可能的方法来解决这个问题将是提高在爪蟾的转基因株系,如下面所讨论。
其中一个此协议的主要限制是,虽然该协议能充分迪stinguish神经元细胞的两个主要的池,即SOX3表达神经干细胞池和MYT1表达分化的神经元,但它缺乏揭示分化的神经元的不同亚群的能力。这样的子种群,这包括,但不限于,主运动神经元,的interneurons,和感觉神经元,通常特征在于它们的差异表达的标记基因28-30。如上所述,最近在多色的原位杂交在爪蟾胚胎的基于抗体的免疫检测方法相结合的发展进步可以在间隙中填以显示分化的神经元的这些亚种群潜在调查31。另外,如在小鼠模型已被证实,它也将被期望的,以提高更全面组细胞类型特异性抗体的爪蟾区分这样不同的细胞群。
它是还值得一提的是,作为除了该方法,最近在光学成像和图像分析的进步,如多光子显微镜,三维重建,和分割,也可以应用于之后的初始评估,以实现爪蟾卵母细胞的更全面的观察以及早期胚胎,特别是在现场设置32,33。因此,要跟踪的增殖,分化,和在活体动物神经元细胞的运动,将它希望建立窝藏通过细胞类型特异性启动子驱动的荧光蛋白质,以允许在爪蟾早期这样的细胞群体的活观察中的一个或多个转基因品系胚胎。建立一个X的与特定的神经β微管蛋白启动子驱动tauGFP及其应用蟾线提供了一个很好的例子23,34。既SOX3和MYT1特征脊椎动物35-37的完整启动子序列,它是SH乌尔德相对容易地建立在爪蟾附加转基因品系应广泛地两个爪和初级神经发生研究的更一般的领域作出贡献。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢在科罗拉多大学博尔德分校教授迈克尔·Klymkowsky和南希Papalopulu教授在曼彻斯特大学的好心提供抗SOX3和抗MYT1抗体,分别为。我们感谢Papalopulu实验室的成员在发展这个协议的有见地的建议。这项工作是由两个治疗基金会助学金,以深圳和JL支持,从治疗基金会SZ / EA和JL / EA分别从威康信托基金会,以EA(WT082450MA)一个程序拨款,一个机构的战略支持授权二级项目资助从威康信托[097820 / Z / 11 / Z]。
gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
MOPS | Sigma-Aldrich | RDD003 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Base Mould Disposable 15Mm X 15Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-015A | |
Base Mould Disposable 7Mm X 7Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-010K | |
Superfrost Plus slides | ThermoFisher | 12-550-15 | |
Tissue Freezing Medium (OCT) | Leica | 14020108926 | |
Cryostat | Leica | CM3050 | |
Gloves | |||
Dry Ice | |||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
85-90°C Heat block | |||
PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
Acetone, analytical grade | |||
Staining jar with slide racks | |||
Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside) | |||
anti-acetylated tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | |
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) | Cell Signaling | 4408 | |
Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) | Cell Signaling | 4413 | |
Alexa Fluor® 647 Phalloidin | Cell Signaling | 8940 | |
DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36930 |